Gruppo di lavoro SIF sulla Farmacogenetica
NEWSLETTER numero 12 - Novembre 2009

POLIMORFISMO MDR1 C3435T: RELAZIONE TRA RISCHIO DI TUMORE AL SENO E RISPOSTA ALLA TERAPIA

A cura delle Dott.sse Gloria Ravegnini e Sabrina Angelini

A tutt’oggi il cancro al seno è uno dei tumori maggiormente diagnosticati tra le donne dei paesi industrializzati. Il numero di interventi terapeutici efficaci per la cura del tumore al seno è in ascesa, tuttavia, le variazioni interindividuali nel responso terapeutico e la tossicità osservata costituiscono un issue importante del suo trattamento. Alcuni studi recentemente hanno evidenziato che varianti genetiche a livello della superfamiglia dei trasportatori di membrana ATP-binding cassette (ABCBs o MDR1) possono contribuire allo sviluppo di patologie tumorali e alla variabilità di risposta al trattamento chemioterapico osservata. Il prodotto del gene MDR1, la glicoproteina P (PgP), è una pompa di efflusso attiva per una grande varietà di tossine, cancerogeni, e farmaci. Attualmente si conoscono più di 100 varianti di MDR1; una di queste è localizzata sull’esone 26 [C3435T; (rs623214 ndr)], ed è stata associata con un’alterata funzionalità di PgP.

Sulla base dei dati riportati in letteratura gli autori hanno voluto indagare la relazione tra il polimorfismo MDR1 C3435T e la suscettibilità a sviluppare tumore al seno nonché la risposta, intesa come efficacia e sicurezza, ai regimi chemioterapici con antracicline.

Lo studio in esame complessivamente ha coinvolto 334 donne, di cui 221 affette da tumore al seno e 113 controlli sani, tutti di origine Caucasica. Le pazienti sono state sottoposte a diversi regimi terapeutici (chemioterapia, radioterapia, terapia ormonale), ma gli autori hanno voluto indagare l’associazione tra il polimorfismo C3435T e la riposta al regime chemioterapico con antracicline [Epirubicina (E) e Doxorubiina (A)] che generalmente consiste nel trattmento con l’associazione 5-Fluorouracile (5-FU), l’antraciclina (E oppure A) e ciclofosfamide (C) (regimi 5-FUEC, 5-FUAC, AC), combinata con radioterapia (n. 111 pazienti totali di cui 38 pazienti in terapia neoadiuvante, 102 in terapia neoadiuvante e/o adiuvante e 9 in trattamento palliativo).
DNA genomico è stato estratto da sangue intero mediante tecniche convenzionali; lo SNP C3435T è stato analizzato tramite PCR-RFLP. Per quanto riguarda la valutazione della risposta alla terapia la popolazione è stata distinta in responsivi (pazienti che hanno dato risposta completa o parziale alla terapia) e non responsivi (malattia stabile o in progressione). L’OD e il corrispondente 95% CI sono stati usati per il calcolo delle relative associazioni. La curva di Kaplan-Meier è stata impiegata per valutare il tempo alla progressione (TTP), inteso come tempo che intercorre tra la diagnosi della malattia e la comparsa di metastasi; l’associazione tra TTP e lo SNP MDR1 C3435T è stata valutata tramite log-rank test.

I risultati ottenuti mostrano che il genotipo MDR1 3435TT è presente nel 30,3% dei pazienti e nel 21,2% dei controlli; la frequenza dell’allele T è del 54.8% per i pazienti e 45.1% nei controlli. Nel complesso i risultati evidenziano una differenza significativa sia nella frequenza allelica (C vs T P = 0019) che nel genotipo (CC vs TT P = 0020; CC vs CT+TT P = 0040) tra casi e controlli. Il genotipo TT, in particolare, sembra associato ad un rischio maggiore di sviluppare tumore al seno (OR= 2.12; 95% CI= 1.12-4.43).
Per quanto concerne la risposta alla terapia, è stata evidenziata un’associazione significativa tra lo SNP C3435T ed il successo del trattamento chemioterapico neoadiuvante con antracicline (n.38 pazienti), indipendentemente dal sottotipo istologico del tumore. Il trattamento, in particolare ha maggior probabilità di successo nelle pazienti con l’allele C [C vs T P = 0.042 (OR = 2.60; 95% CI = 1.03-6.58); CC vs TT P = 0.021 (OR = 28.60; 95% CI = 1.12-732.10); CC vs CT+TT P = 0.017 (OR = 16.70; 95% CI = 0.85-327.60)]. L’associazione tra il TTP e lo SNP è stata valutata su 102 pazienti in regime terapeutico neoadivante e adiuvante con antracicline. Il TTP medio per le pazienti con genotipo CC è di 121.8 mesi (95% CI=48-195.6), mentre per quelle con genotipo CT + TT è di 43.25 mesi (95% CI=40.7-45.8); la differenza è risultata al margine della significatività statistica (P = 0.049). Le pazienti con genotipo CT + TT sono caratterizzate da un rischio di progressione della patologia di 2,28 volte rispetto a quelle con genotipo wild-type CC.
L’occorrenza di episodi di tossicità ematica dopo trattamento con regimi chemioterapici a base di antracicline è un problema rilevante nei pazienti con tumore al seno. Nel gruppo di pazienti in studio (n. 111) l’effetto avverso che si è manifestato più frequentemente è la neutropenia (33,3% delle pazienti); in alcune pazienti si sono manifestati effetti tossici diversi. Nessuno degli effetti tossici evidenziati è risultato associato con il genotipo o la frequenza allelica di MDR1 C3435T.

VARIANTI GENETICHE CON “PERDITA DI FUNZIONE” A CARICO DEL GENE CYP2C9 MIGLIORANO LA RISPOSTA AL TRATTAMENTO DEL DIABETE DI TIPO II CON SULFANILUREE: PRESENTAZIONE DELLO STUDIO GO-DARTS

A cura delle Dott.sse Cristina Tonello e Greta Milani

Il diabete è una malattia cronica caratterizzata dalla presenza di elevati livelli di glucosio nel sangue (iperglicemia), dovuta a un’alterata quantità o funzionalità dell’insulina, ormone prodotto dal pancreas che media l’ingresso del glucosio  nelle cellule e il suo conseguente utilizzo come fonte energetica. Quando questo meccanismo è alterato, il glucosio si accumula nel circolo sanguigno. Il diabete di tipo II è la forma più comune di questa patologia e rappresenta circa il 90% dei casi. La causa è ancora ignota, anche se è certo che il pancreas è ancora in grado di produrre insulina, ma le cellule dell’organismo non riescono poi ad utilizzarla. In genere, la malattia si manifesta dopo i 30-40 anni e sono numerosi i fattori di rischio riconosciuti come associati alla sua insorgenza: familiarità, scarso esercizio fisico, sovrappeso e l’appartenenza ad alcune etnie.
Questa patologia viene trattata con diete ipolipidiche, antidiabetici orali e solo in rari casi si verifica la necessità di un trattamento insulinico. Gli antidiabetici orali sono farmaci ipoglicemizzanti e sono classificabili in due gruppi: i) la classe delle Biguanidi: farmaci che agiscono principalmente aumentando la penetrazione intracellulare del glucosio a livello periferico; ii)  la classe delle sulfaniluree: farmaci che agiscono sia stimolando la liberazione di insulina residua del pancreas sia diminuendo la liberazione in circolo del glucosio immagazzinato nel fegato. Il meccanismo d’azione delle sulfaniluree porta alla chiusura dei canali del potassio delle cellule b-pancreatiche con conseguente incremento della secrezione di insulina.
La risposta a questa seconda classe di farmaci è molto variabile e non si conoscono ancora i fattori che influiscono sul trattamento. Sono note due varianti genetiche che determinano una peggior risposta alle sulfaniluree: i) Ser1369Ala a livello del gene ABCC8, che codifica per la sub unità SUR1 del canale del potassio; ii) rs12255372 sul gene TCLF7L2.
Le sulfaniluree sono metabolizzate principalmente a livello epatico, nei caucasici ad opera del citocromo P450 2C9 (CYP2C9), codificato dal gene CYP2C9. Studi farmacocinetici hanno mostrato che due varianti, relativamente comuni, di questo gene influiscono sul metabolismo del farmaco: i genotipi *2/*2 e *3/*3 hanno una clearance più bassa per il farmaco glibenclamide rispetto ad individui portatori degli alleli wild type, rispettivamente del 25% e 57%. Un altro studio ha evidenziato lo stesso trend per il farmaco tolbutamide.

Gli autori di questo studio hanno ipotizzato che gli individui portatori delle varianti alleliche CYP2C9 *2 e *3, che determinano una perdita di funzionalità dell’enzima, manifestassero una maggiore risposta alle sulfaniluree in conseguenza di una maggiore esposizione al farmaco. Presso il Diabetes Research Group della University of Dundee, sono stati esaminati 1.073 pazienti diabetici, in trattamento con sulfaniluree (glicazide, glipizide, glibenclamide e glimepiride) da almeno 6 mesi,  per un anno e mezzo. I soggetti sono stati divisi in due gruppi: 578 pazienti naive in monoterapia e 495 pazienti, che avendo assunto metformina prima dello studio, erano in terapia con sulfaniluree e metformina stessa.
L’emoglobina glicosilata (HbA1c) rappresenta un marker di controllo glicemico, in quanto rappresenta l’andamento glicemico del paziente per le 4-6 settimane precedenti. Individui portatori del genotipo *2/*2 o *3/*3 (circa 6 su 10) hanno 3,4 volte più probabilità di raggiungere un livello ottimale di glucosio nel sangue rispetto alle persone portatrici degli alleli wild type (*1/*1). La presenza di queste varianti allo stato eterozigote comporta un valore migliore di HbA1c, ma non in maniera statisticamente significativa.
Inoltre i portatori delle varianti *2 e *3 hanno una riduzione dello 0,5% delle concentrazioni di HbA1c rispetto a pazienti portatori dell’allele *1; individui eterozigoti hanno mostrato riduzioni del parametro, ma le differenze con i soggetti wild type non sono statisticamente significative.
Attraverso un’analisi di regressione, gli autori hanno rivelato come la presenza di una delle varianti con perdita di funzione riduca il rischio di fallimento del trattamento nel gruppo di pazienti in monoterapia.
Sono stati inoltre osservati i trattamenti di 273 pazienti in monoterapia con sulfaniluree: è stato necessario un incremento del 5% della dose in individui wild type o eterozigoti; invece individui portatori delle varianti *2 e *3 in omozigosi non hanno avuto bisogno di cambiamenti nella somministrazione del farmaco.
Gli individui portatori in omozigosi delle varianti con perdita di funzione dell’enzima metabolizzano meno le sulfaniluree rispetto ai portatori in eterozigosi. Quindi, in questi individui la biodisponibilità delle sulfaniluree è maggiore.
Studi di farmacocinetica riguardo al metabolismo di tolbutamide e glibenclamide su una piccola casistica di pazienti hanno suggerito che individui *1/*1 e *1/*2 non hanno differenze; pazienti portatori dei genotipi *2/*2, *1/*3 e *2/*3 hanno effetti intermedi, mentre portatori di *3/*3 hanno compromissioni gravi nel metabolismo del farmaco. L’80% dei pazienti di questo studio è stato trattato con glicazide: purtroppo non esistono in letteratura studi sulla correlazione tra genotipi del gene CYP2C9 e metabolismo del farmaco.

EFFETTO DI UN POLIMORFISMO DEL GENE CYP2D6 SULL’EFFICACIA DI DONEPEZIL IN PAZIENTI CON MALATTIA DI ALZHEIMER

A cura del Dott. Salvatore Terrazzino

Il donepezil è un inibitore specifico dell’acetil-colinesterasi utilizzato nel trattamento sintomatico della malattia di Alzheimer (AD) di grado lieve o moderato. Malgrado non sia efficace nel ridurre la progressione della malattia, la terapia con donepezil si è dimostrata efficace nel rallentare il deterioramento delle funzioni cognitive e comportamentali dei pazienti affetti da AD. Dopo somministrazione orale, più del 90% di donezepil viene inattivato ad opera principalmente degli enzimi epatici CYP2D6 e CYP3A4. Studi recenti mostrano che il polimorfismo -1584C>G nel gene Cyp2D6 è associato ad una maggiore attività enzimatica in vivo e permette di identificare i pazienti metabolizzatori ultrarapidi dell’enzima CYP2D6. In questo studio gli Autori hanno valutato l’influenza del polimorfismo -1584C>G del gene Cyp2D6 sull’efficacia della terapia anticolinesterasica con donepezil in pazienti con AD di grado lieve o moderato.

In questo studio prospettico multicentrico sono stati arruolati 127 pazienti con AD (46 maschi/81 femmine, età media 74.09 ±8.81, range 65-94 anni). I criteri di inclusione sono stati i seguenti: razza bianca, età ≥ 65 anni, diagnosi di AD probabile di grado lieve o moderato secondo i criteri NINCDS-ADRDA. I pazienti arruolati sono stati sottoposti alla terapia con donepezil alla dose di 5mg/day per 1 mese. Successivamente, coloro che non avevano sviluppato effetti collaterali clinicamente rilevanti sono stati sottoposti alla terapia con donepezil alla dose di 10 mg/day per altri 5 mesi. Lo stato cognitivo dei pazienti è stato valutato mediante l’utilizzo delle scale ADAS-Cog (Alzheimer’s Disease Assessment Scale-Cognitive Section) e MMSE (Mini-Mental State Examination), mentre lo stato funzionale dei pazienti è stato valutato mediante gli indici ADL (Activities of Daily Living) e IADL (Instrumental Activities of Daily Living). In accordo con i criteri stabiliti dalla National Institute for Health and Clinical Excellence (NICE), sono stati definiti responders i pazienti che al termine del trattamento con donepezil avevano un miglioramento dello stato funzionale e che presentavano un miglioramento dello stato cognitivo oppure l’assenza di un suo deterioramento.

Durante il follow-up, 12 pazienti (1 maschio e 11 femmine) hanno dovuto interrompere il trattamento con donepezil per la presenza di effetti avversi clinicamente rilevanti che comprendevano nausea e vomito (n=3), bradicardia (n=1), dolore addominale (n=2), vertigini (n=2), diarrea (n=3) ed ipotensione ortostatica (n=1). Dei restanti 115 pazienti, 69 (60%) sono stati classificati responders e 46 (40%) nonresponders al trattamento con donepezil. Come atteso, i pazienti responders differiscono dai nonresponders nei punteggi ottenuti alle scale ADAS-Cog (p<0.001), MMSE (p<0.001), ADL (p<0.001) e IADL (p<0.001), mentre tra i due gruppi di pazienti non si osservano differenze significative riguardo l’età, la distribuzione maschi/femmine, terapie e malattie concomitanti. I risultati della genotipizzazione mostrano che le frequenze genotipiche osservate per il polimorfismo -1584C>G del gene Cyp2D6 (CC, n=64; CG, n=41, GG, n=10) rispettano l’equilibrio di Hardy-Weinberg. La distribuzione del polimorfismo -1584C>G differisce in maniera significativa tra i pazienti responders e nonresponders al trattamento con donepezil (p=0.006). In particolare, i pazienti portatori dell’allele G del polimorfismo -1584C>G si riscontrano più frequentemente tra i nonresponders piuttosto che non tra i responders (58.7% vs 34.8%, p=0.013). L’analisi di regressione logistica aggiustata per i fattori età, sesso, punteggio iniziale alla scala MMSE e genotipo APOE mostra che i portatori dell’allele G hanno un rischio maggiore di non rispondere al trattamento con donepezil, rispetto ai pazienti con genotipo CC (OR: 3.431,  95% IC: 1.490-7.901). L’analisi multivariata mostra inoltre che, a differenza del polimorfismo -1584C>G del gene CYP2D6, il polimorfismo dell’APOE non risulta un fattore indipendente predittivo della risposta al trattamento con donepezil. Infatti, l’analisi di regressione logistica aggiustata per i fattori età, sesso, punteggio basale alla scala MMSE e CYP2D6 non mostra differenze significative tra responders e nonresponders per quanto riguarda la distribuzione dei genotipi APOE e3/e4 (p=0.111) oppure APOE e4/e4 (p=0.305).

Punti di forza dello studio: i) disegno prospettico dello studio ii) esclusione dei pazienti con potenziali fattori confondenti, quali l’utilizzo concomitante di altri farmaci metabolizzati da CYP2D6 (tra cui anticolinergici, anticonvulsivanti, antidepressivi, beta-bloccanti e farmaci antipsicotici), iii) utilizzo di criteri stringenti per la definizione dei pazienti responders; iv) adeguato potere statistico dello studio. L’analisi post hoc ha infatti evidenziato un potenza dello studio del 85%, con una dimensione dell’effetto o effect size di 0.57. Il maggior limite dello studio è quello di non aver valutato i livelli circolanti del farmaco, cosa che avrebbe permesso di valutare in vivo il ruolo funzionale del polimorfismo -1584C>G del gene Cyp2D6. Gli autori suggeriscono che l’analisi di tale polimorfismo potrebbe essere un valido approccio per l’identificazione dei pazienti con un maggior rischio di non rispondere alla terapia con donepezil. L’utilità clinica del test farmacogenetico è tuttavia limitata dal fatto che esistono ancora dubbi sulla effettiva efficacia di donepezil sul miglioramento della funzione cognitiva in pazienti con AD.

LA VARIANTE GENETICA SLCO1B1*5 E’ ASSOCIATA AGLI EFFETTI COLLATERALI INDOTTI DALLE STATINE: LO STUDIO STRENGHT (Statin Response Examined by Genetic Haplotype Markers)

A cura della Dott.ssa Valentina Boscaro

Le statine sono farmaci ampiamente prescritti per la prevenzione dell’infarto del miocardio e dello stroke e il loro uso riduce la mortalità cardiovascolare; nonostante la loro efficacia, nel 25-50% dei pazienti la compliance a un anno è bassa, prevalentemente per gli effetti collaterali lievi indotti, soprattutto a livello muscoloscheletrico, che nella pratica clinica si manifestano nel 5-10% dei pazienti. Lo sviluppo di tali effetti collaterali è stato associato a SNP che influenzano l’attività degli enzimi metabolici; in particolare l’allele *5 (Val174Ala, rs4149056) del trasportatore epatico SLCO1B1 interferisce con la localizzazione del trasportatore a livello della membrana e determina una più alta concentrazione sistemica di questi farmaci. In uno studio genome-wide tale allele è stato identificato come causa dominante di miopatia grave in pazienti in terapia con simvastatina 80mg (Link E et al. N Engl J Med 2008, 359: 78-99; SIF-Farmacogenetica n° 0, ottobre 2008).

Obiettivo di questo studio è invece identificare comuni polimorfismi che determinano una ridotta funzionalità di enzimi metabolici e di trasportatori e che potrebbero essere associati a effetti collaterali lievi indotti da statine, in particolare quelli senza aumento di creatin chinasi (CK).

Lo studio STRENGHT, condotto tra il 2001 e il 2002, in aperto, della durata di 16 settimane, è uno studio di farmacogenetica su efficacia e sicurezza delle statine, in cui 509 pazienti non ospedalizzati con ipercolesterolemia sono stati randomizzati a ricevere per 8 settimane atorvastatina 10mg/die o simvastatina 20mg/die o pravastatina 10mg/die, seguite da atorvastatina 80mg/die o simvastatina 80mg/die o pravastatina 40mg/die rispettivamente. L’outcome primario è stato la comparsa di eventi avversi composti (CAE) in qualsiasi momento dello studio: interruzione prematura della somministrazione del farmaco per qualsiasi effetto collaterale, mialgia o crampi notturni, indipendentemente dai valori di CK, aumento di CK > 3 rispetto al limite superiore. Sono stati sequenziati o genotipizzati oltre 160 potenziali geni candidati e al fine di questa analisi, l’attenzione è stata focalizzata su 5 geni (CYP2D6, CYP2C8, CYP2C9, CYP3A e SLCO1B1) coinvolti nella farmacocinetica delle statine, sulla base delle informazioni ottenute dal database PharmGKB (Klein TE et al. Pharmacogenomics J  2001, 1:167-70) e di recenti review sul pathway delle statine (Mangravite LM et al. Pharmacogenomics J  2006, 6:360-74).

In totale 452 soggetti (88% dei partecipanti allo studio) hanno ricevuto una terapia con statine ed erano disponibili per il follow up; 99 (22%) hanno manifestato almeno un evento di CAE: 54 hanno interrotto la terapia per qualsiasi evento avverso, 61 hanno sviluppato mialgia/crampi muscolari e 9 un innalzamento di CK > 3 volte il limite superiore. Le caratteristiche basali della coorte intera (56 10 anni, maschi 209 – 46%) e delle coorti che hanno manifestato o meno CAE (CAE: 58 10 anni, maschi 33 – 33%; no CAE 56 11 anni, maschi 176 – 50%) erano simili, fatta eccezione per il sesso, con una maggiore percentuale di donne nel gruppo CAE (OR=2,0, 95% CI 1,2 – 3,1, p=0,004).

Un SNP in SLCO1B1 (SLCO1B1*5, rs4149056, V174A) influenza l’outcome primario nello studio STRENGHT (chi-square=4,2, p=0,03); nell’analisi multivariata aggiustata per razza, sesso e genotipo SLCO1B1*5 sono indipendentemente associati a CAE (OR=2,2, 95% CI 1,4 – 3,6, p=0,001 e OR=1,7, 95% CI 1,04 – 2,8, p=0,03 rispettivamente). E’ stato osservato un effetto dose-gene dipendente: la percentuale di individui con CAE cresce all’aumentare del numero di alleli SLCO1B1*5 [per noncarrier – n=325, carrier  di 1 allele – n=115 e carrier di 2 alleli – n=8 la proporzione di CAE era rispettivamente 0,19 (95% CI 0,15-0,24), 0,27 (95% CI 0,19 – 0,36), 0,50 (5% CI 0,16 – 0,84)]. Dei 99 pazienti che sono andati incontro a CAE, la maggior parte (n=61 – 62%) li ha sviluppati nelle prime 8 settimane, durante il trattamento a basse dosi; quando l’analisi è ristretta a tale popolazione, il sesso femminile e il genotipo SLCO1B1*5 continuano a essere associati a CAE (p=0,009 e p=0,003 rispettivamente). L’incidenza di CAE è stata più elevata nei carrier di almeno un allele SLCO1B1*5 in terapia con simvastatina, simile in quelli trattati con atorvastatina e pravastatina, anche se tale trend non è statisticamente significativo. La concentrazione del metabolita della simvastatina è positivamente correlata a SLCO1B1*5 sia a basse (20mg) che alte (80mg) concentrazioni (p=0,006 e p=0,03 rispettivamente), mentre questa relazione non è evidente per la pravastatina.
L’analisi è stata limitata ai 90 pazienti che non hanno manifestato innalzamento di CK > 3 volte il limite superiore, per verificare se SLCO1B1*5 fosse correlato ad effetti collaterali lievi senza aumento di CK: l’associazione tra SLCO1B1*5 e sesso con effetti collaterali lievi rimane ed è rafforzato.

Gli autori sottolineano alcuni punti deboli dello studio, come la mancanza di un gruppo trattato con placebo che possa permettere di identificare il contributo del genotipo SLCO1B1*5 nello sviluppo di eventi avversi, visto che diversi trial,controllati con placebo, hanno evidenziato un’incidenza di effetti collaterali simile nei pazienti trattati con statine o con placebo. Inoltre nello studio è stato utilizzato un end point composto, anche se i risultati ottenuti sono stati confermati analizzando la sola popolazione senza significativo aumento di CK. Punti di forza dello studio sono invece il chiaro razionale biologico nella scelta dei geni candidati e degli SNP basati nella farmacogenetica nota delle statine e il fatto di aver testato l’ipotesi fatta nel contesto di un grande studio prospettico.