SOCIETA' ITALIANA DI FARMACOLOGIA
Relazioni dei borsisti sif
RELAZIONE
ATTIVITA’ SCIENTIFICA
GIUGNO 2004 - LUGLIO 2004
Dott.ssa Alessandra Levato
Department
of Biology
University College of London
Attività scientifica svolta dalla Dott.ssa Alessandra Levato presso i laboratori del Department of Biology dell’University College of London presso la guida del Prof. John Wood nell’ambito del Dottorato di Ricerca in Farmacologia e Biochimica della Morte Cellulare.
Il periodo di training svolto nei laboratori del Molecular Nociception Group, gruppo di ricerca esperto nello studio multidisciplinare della conduzione dolorifica, a partire dall`otto Giugno 2004 fino al quattordici Luglio 2005 mi ha permesso di ampliare le conoscenze, sia tecniche che intellettuali, in tale campo della ricerca scientifica e di acquisire un metodo di valutazione critica dei risultati sperimentali.
Dopo aver sostenuto, come previsto dall`Animal (Scientific Procedures) Act 1986, l`esame per l`ottenimento della Personal Licence che consente di effettuare le procedure chirurgiche e gli studi comportamentali necessari, ho imparato a riprodurre diversi modelli animali di dolore, sia di tipo neuropatico (Spinal Nerve Ligation, Diabetic-induced Neuropathy) che infiammatorio (Formalin test, Carrageenan model, NGF e PGE2-induced hyperalgesia) al fine di poter scegliere il modello di dolore piu` adatto per il mio progetto di ricerca.
Il modello della Spinal Nerve Ligation (Kim & Chung., 1992) prevede l`esposizione e la ligatura con 6.0 thread del nervo spinale L5 nel topo e dei nervi spinali L5 e L6 nel ratto. I nervi spinali L5 e L6 afferiscono al nervo sciatico insieme al nervo L4. Mentre l`iperalgesia termica si sviluppa in 3 giorni e dura circa 5 settimane, l`allodinia meccanica si sviluppa un giorno dopo la chirurgia, raggiunge il suo picco una settimana dopo e comincia a scemare dopo 14 settimane. Inoltre spesso si riscontrano segni di dolore spontaneo a partire da un giorno dopo la chirurgia. Il modello della Diabetic-induced Neuropathy (Wang & Wang., 2003) prevede la somministrazione di streptozotocina (i.p., 1 mg/Kg) per una sola volta nel ratto e per 5 giorni consecutivi nel topo. La streptozotocina e` un antibiotico che possiede tossicita` selettiva per le cellule pancreatiche, determinando la comparsa di diabete in circa 3 settimane. Livelli di glicemia superiori ai 15 mM/Kg sono indice della presenza di diabete. Il formalin test (Dubuisson & Dennis., 1977) prevede la somministrazione di una soluzione acquosa di formalina al 5% (s.c., 20 l) nella zampa posteriore di topo e 50 l nel ratto. Si determina il licking/biting behaviour durante l`ora successiva alla somministrazione. Il test della formalina e` caratterizzato da una risposta comportamentale nocicettiva bifasica in cui la prima fase dura approssimativamente 10 minuti, mentre la seconda, che avviene in seguito ad un periodo di latenza di circa 10 minuti, dura 40 minuti. Diversi dati sperimentali suggeriscono che la prima fase sia causata dalla diretta attivazione delle fibre C dei nocicettori, mentre la seconda fase sia determinata dalla risposta infiammatoria. Tuttavia cambiamenti indotti durante la prima fase a livello del midollo spinale sembrano contribuire allo sviluppo della seconda fase. Il modello della carrageenan prevede la somministrazione sottocutanea di carrageenan all`1% nella zampa posteriore di ratto. Il modello della carrageenan prevede la somministrazione sottocutanea di carrageenan all`1% nella zampa posteriore di ratto. I carrageenans sono un complesso gruppo di polisaccaridi, estratti dalle alghe rosse, costituiti da mononeri galattosidici ripetuti che formano gels termoreversibili. Il Complete Freud`s Adjuvant e` un emulsione acqua-olio contenente componenti della parete batterica del mycobacterium butyricum (<0.5 mg/Kg) che induce una risposta infiammatoria. La somministrazione intradermica di CFA nella base della coda di topo/ratto risulta in un modello di poliartrite (Millan et al., 1986), mentre la somministrazione intraplantare (Millan et al., 1988) di CFA nel ratto induce infiammazione ed edema che compaiono dopo poche ore e durano per 5 settimane. L`iperalgesia termica e meccanica raggiungono il picco dopo 24 ore, ma persistono per l`intero periodo. Per quanto riguarda il dolore neuropatico esistono altri modelli animali animali quali il Chronic Constriction Injury (CCI), la Partial Sciatic Nerve Ligation (PSL). Il CCI model (Bennett and Xie., 1988) prevede l’esposizione del nervo sciatico a mezza coscia per 4-5 mm e quattro ligature (4.0 chromic gut) intorno al nervo in prossimità della triforcazione del nervo sciatico a distanza di 1 mm l’uno dall’altro. Gran parte del danno da CCI è dovuto all’infiammazione determinata dal cromo presente nelle sutures (Maves et al., 1993). Il modello PSL (Seltzer et al., 1990) prevede l’esposizione del nervo sciatico nella coscia superiore e la ligatura con un filo di seta 8.0 in un sito adiacente al punto in cui il bicipite posteriore ed il nervo semitendineo si diramano. Tuttavia tra i diversi modelli di dolore neuropatico la spinal nerve ligation, consistendo nella ligatura di un solo nervo spinale che afferisce a formare il nervo sciatico, presenta il vantaggio di permettere indagini sperimentali specifiche sui dorsal root ganglion (DRG) e/o sulle porzioni di midollo spinale corrispondenti al nervo danneggiato e non. Accanto ai numerosi modelli animali di dolore sono stati elaborati anche diversi metodi per lo studio della risposta nocicettiva. Durante il mio periodo di soggiorno all’estero ho imparato ad utilizzare i diversi test comportamentali per lo studio della risposta nocicettiva in seguito ad uno stimolo meccanico (Von Frey test, Randall-Selitto), termico (l`Haregreaves test, Hot Plate test) e chimico (licking/biting behaviour). Il Von Frey hairs test e` stato descritto da diversi autori (Fuchs et al., 1999; Kim & Chung., 1992; Seltzer et al., 1990) come metodo per determinare la presenza di allodinia meccanica utilizzando filamenti numerati di diversa rigidita` che imprimono una forza incrementale secondo una scala logaritmica (Von Frey hairs). Tali filamenti vengono applicati sulla superficie plantare della zampa posteriore per 3-5 secondi. Per determinare la risposta di withdrawal in seguito all`applicazione dei Von Frey hairs esistono due metodi: il full battery testing (Fuchs et al., 1999) che permette di calcolare la percentuale di risposta e l`up-down method (Chaplan et al., 1994; Dixon 1980) che consente di determinare il valore corrispondente al 50% della soglia di withdrawal. Io ho imparato ad utilizzare il metodo up-down che consente nell`utilizzare come primo filamento quello corrispondente al 50% della soglia di withdrawal e successivamente un filamento di forza crescente in seguito ad assenza di risposta e uno di forza decrescente in seguito a presenza di risposta. Il test continua fino a che si ottengono almeno sei misurazioni intorno al valore del 50% di withdrawal threshold. Il Randall-Selitto test (Takesue et al., 1969) prevede la misurazione del peso corrispondente alla risposta di withdrawal in seguito all`applicazione di una forza meccanica crescente sulla coda di topo o sulla coda/zampa posteriore di ratto. Il test di Haregreaves (Haregreaves et al., 1988) consiste, invece, nella proiezione di una sorgente di calore radiante sulla zampa di ratto/topo e permette di determinare l`eventuale presenza di iperalgesia termica misurando il tempo di reazione. L`Hot Plate test (Woolfe 1944) prevede la determinazione della latenza di withdrawal della zampa in seguito al riscaldamento della piastra metallica sulla quale e` posto l`animale ad una temperatura compresa tra i 50 e i 55 gradi centigradi. Inoltre ho imparato ad effettuare il Rotarod test (Janes & Roberts., 1968) che è il test più utilizzato per valutare le capacita` motorie dell`animale e prevede l`uso di un cilindro rotante sul quale l`animale deve camminare per evitare di cadere. Consiste quindi nella misurazione del tempo in cui il topo/ratto riesce a stare in equilibrio sul cilindro. Insieme a tecniche chirurgiche e di studio comportamentale ho trovato interessante imparare ad utilizzare alcune tecniche di biologia molecolare per la genotipizzazione di topi provenienti da mamme nelle quali blastocisti sono state impiantate cellule staminali Knock-out per un determinato gene. Tali metodiche sono: l`estrazione del DNA dalla coda di topo, l`amplificazione del DNA tramite la Polimerase Chain Reaction (o PCR) e la genoelettroforesi. La visualizzazione delle bande ottenute permette di conoscere l`espressione del gene di interesse cioe` se il topo e` knock-out (non esprime il gene), se e` eterozigote (esprime il gene in un solo allele) oppure e` wild-type (esprime il gene in entrambi gli alleli). Infine, ho imparato a prelevare i dorsal root ganglion (DRG) dal topo e dal ratto e a preparare le colture cellulari dei DRG neurons. Ho inoltre partecipato a diversi progetti di ricerca. Tali progetti erano finalizzati allo studio del ruolo dei diversi sottotipi di canali al sodio voltaggio dipendenti e del Brain-Derived Neurotrophic Factor (BDNF) nei diversi modelli di dolore tramite l’uso di topi nociceptor-specific knock-out per tali geni. Tissue-specific knock-out sono stati prodotti utilizzando il sistema del Cre-loxP (Le and Sauer 2001; Nagi 2000) che permette di incrociare topi che esprimono la Cre-recombinase selettivamente nei DRGs con topi contenenti il gene target affiancato da due lox-P sytes (floxed gene). Per ottenere topi nociceptor-specific knock out la Cre-recombinase è stata specificamente espressa nei nocicettori guidando il gene con il promotore Nav1.8 (Stirling et al. 2005). Il gene che codifica per il canale al sodio voltaggio dipendente Nav1.8 è espresso selettivamente nei neuroni nocicettivi ed è completamente assente in altri tessuti (Akopian et al. 1999). Inoltre tale esperienza formativa è stata di fondamentale importanza per ampliare la conoscenza della letteratura scientifica riguardante i meccanismi neurochimici alla base del dolore cronico.
Durante tale periodo di permanenza all’estero ho avuto anche l’opportunità di interagire con ricercatori esperti nel campo del dolore, di perfezionare la conoscenza della lingua inglese e di partecipare alle seguenti attivita` congressuali e seminariali:
8-09-2004 (University College of London):
Prof.
Hiroshi Ueda (Nagaroshi University, Japan)
“Pain
and memory”
“Role
of lysophosphatidic acid in the initiation of neuropathic
pain”
13-10-2004 (University College of London):
Dr.
David Wynick (Department of Molecular Medicine, University
of Bristol)
”Identification
and validation of novel factors involved in the adaptive response
of the nervous system to injury”
3-11-2004 (University College of London):
Dr
Kenji Okuse (Department of Biological Sciences, Imperial College,
London)
"Novel
accessory subunits for voltage-gated sodium channel"
5-11-2004 (University College of London):
Novartis
seminar
“Identifying
endogenous activators of the cold sensitive ion channel TRPMs”
24-11-2004 (University College of London):
Dr.
Andy Randall (Neurology and GI CEDD, GlaxoSmithKline and MRC
Centre for Synaptic Plasticity, University of Bristol)
“What
do electrophysiologists do at GlaxoSmithKline? A year of neurophysiology
in pain, Alzheimer's and gastrointestinal drug discovery”
8-12-2004 (University College of London):
Prof.
Bill Catterall (Washington University, Seattle)
“Structure
and Regulation of Calcium Channels by Signaling Complexes”
17-03-2005 (King’s College London)
The
London Pain Consortium Clinical Meeting:
Dr
Amanda Williams (London)
“What’s
hot and what’s not in the psychology of mood and pain”
Prof.
Bruce Kidd (Queen Mary University London)
“Why
does arthritis hurt?”
Dr
Mick Serpell (Glasgow, UK)
“Recent
advances in drug therapy for neuropathic pain”
Prof.
Henry McQuay (Oxford, UK)
“Evidence
matters”
Dr
Columba Quigley (Hammersmith Hospital, London)
“Pain,
genes and palliative care”
6-04-2005 (University College London)
Dr
Stuart Bevan (Novartis Institute for Biomedical Research,
London)
“Cool
and minty - TRP channels as transducers for thermosensation”
28-04-2005 (University College London)
Prof.
David Goldstein (UCL, London)
“Pharmacogenetics and antiepileptic drugs”
06-06-05 (University College London)
Prof.
Mike Salter (Centre for the study of pain, University of Toronto)
“Microglia-neuron
signaling in neuropathic pain”
Bibliografia
1.
Akopian et al. (1999). The tetrodotoxin-resistant sodium channel
SNS has a specialized function in pain pathways. Nat. Neurosci.
2, 541-548.
2.
Bennett G.J. & Xie Y.K. (1988). A peripheral mononeuropathy
in rat that produces disorders of pain sensation like those
seen in man. Pain 33, 87-107.
3.
Chaplan S.R., Bach F.W., Pogrel J.W., Chung J.M. & Yaksh
T.L. (1994). Quantitative assessment of tactile allodynia
in the rat paw. J. Neurosci. Methods 23, 55-63.
4.
D`Amour F.E. & Smith D.L. (1941). A method for determining
loss of pain sensation. J. Pharm. Exp. Therap. 41, 74-79.
5.
De Vry J., Kuhl E., Franken-Kunkel P. & Eckel G. (2004).
Pharmacological characterization of the chronic constriction
injury model of neuropathic pain. Europ. J. Pharmacol. 491,
137-148.
6.Dixon
W.J. (1980). Efficient analysis of experimental observations.
Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 20, 441-462.
7.
Dubuisson D. & Dennis S.G. (1977). The formalin test:
a quantitative study of the analgesic effects of morphine,
meperidine and brain stem stimulation in rats and cats. Pain
4, 161-174.
8.
Fuchs P.N., Roza C., Sora I., Uhl G. & Raia S.N. (1999).
Characterization of mechanical withdrawal responses and effects
of mu-, delta- and kappa-opioid agonists in normal and mu-opioid
receptor knock-out mice. Brain Res. 821, 480-486.
9.
Haregreaves K., Dubner R., Brown F., Flores C. & Joris
J. (1988). A new and sensitive method for measuring thermal
nociception in cutaneous hyperalgesia. Pain 32, 77-88.
10.
Hunskaar S., Fasmer O.B & Hole K. (1985). Formalin test
in mice, a useful technique for evaluating mild analgesics
J. Neurosci. Methods 14, 69-76.
11.
Janes B.J. & Roberts D.J. (1968). A rotarod suitable for
quantitative measurements of motor incoordination in naïve
mice. Naunyn Schmiedebergs Arch. Exp. Pathol. Pharmacol. 259,
211.
12.
Kim S.H. & Chung J.M. (1992). An experimental model for
peripheral neuropathy produced by segmental spinal nerve ligation
in the rat. Pain 50, 355-363.
13.
Le and Sauer (2001). Conditional gene knockout using Cre recombinase.
Mol. Biotechnol. 17, 269–275.
14.
Maves T.J., Pechman P.S., Gebhart G.F. & Meller S.T. (1993).
Possible chemical contribution from chromic gut sutures produces
disorders of pain sensation like those seen in man. Pain 54,
57-69.
15.Millan
M.J., Millan M.H., Czlonkowski A., Hollt V., Pilcher C.W.,
Herz A. & Colpaert F.C. (1986). A model of chronic pain
in the rat: response of multiple opioid systems to adjuvant-induced
arthritis. J. Neurosci. 6, 899-906.
16.Millan
M.J., Czlonkowski A., Morris B., Stein C., Arendt R., Huber
A., Hollt V. & Herz A. (1988). Inflammation of the hind
limb as a model of unilateral, localized pain: influence on
multiple opioid systems in the spinal cord of the rat. Pain
35, 299-312.
17.
Nagi (2000). Cre recombinase: the universal reagent for genome
tailoring. Genesis 26, 99-109.
18.
Seltzer Z., Dubner R. & Shire Y. (1990). A novel behavioural
model of neuropathic pain disorders produced in rats by partial
sciatic nerve injury. Pain 43, 205-218.
19.
Stirling et al. (2005). Nociceptor-specific gene deletion
using heterozygous Nav1.8-Cre recombinase mice. Pain 113,
27-36.
20.
Takesue E.I., Schaefer W. & Jukniewicz E. (1969). Modification
of the Randall-Selitto analgesic apparatus. J. Pharmac. Pharmacol.
21, 788-789.
21.
Tjolsen A., Berge O.G., Hunskaar S., Rosland J.H. & Hole
K. (1992). The formalin test: an evaluation of the method.
Pain 51, 5-17.
22.Wang
L.X. & Wang Z.J. (2003). Animal and cellular models of
chronic pain. Adv. Drug Deliv. Rev. 55, 949-965.
23.Woolfe
G. & Mac Donald A.D. (1944). The evaluation of the analgesic
action of pethidine hydrochloride. J. Pharmacol. Exp. Ther.
80, 300-307.