SOCIETA' ITALIANA DI FARMACOLOGIA
Relazioni dei borsisti sif
RELAZIONE
ATTIVITA’ SCIENTIFICA
ANNO 2005
Dott.ssa Isabella
Pighin
Dipartimento
di Farmacologia ed Anestesiologia
Università
di Padova
Lo stress ossidativo è un fattore importante nello sviluppo dell’aterosclerosi, in particolare si ritiene che il metabolismo ossidativo delle LDL costituisca il punto di partenza nel processo aterosclerotico. Recentemente si è osservato che le oxLDL esplicano un duplice effetto sulle cellule endoteliali umane (HUVEC), provocando a basse concentrazioni proliferazione cellulare e ad alte concentrazioni apoptosi ed ipertrofia (Galle et al., 2001;Seibold et al., 2004). Tale processo proliferativo e ipertrofico riscontrato nelle HUVEC trattate con oxLDL, è legato al ruolo delle proteine RhoA (Seibold et al., 2004). Queste proteine fanno parte della famiglia delle “small G proteins” e sono coinvolte in varie funzioni come l’espressione di geni e la riorganizzazione del citoscheletro, soprattutto nella formazione di lamellopodia e filopodia, importanti per il movimento della cellula. Una sottofamiglia delle proteine Rho, le proteine Rac, regolano la formazione e il turnover delle giunzioni intercellulari, ed sono in grado di attivare la PAK (p21-activated kinase) responsabile dell’aumento della permeabilità endoteliale (Stockton et al., 2004). Tale aumento della permeabilità è visibile nell’endotelio aterogeno. Infatti sia in vivo che in vitro, le oxLDL provocano un aumento della permeabilità dell’endotelio portando ad un incremento del rischio di formazione di placche ateromatose.
La citotossicità delle oxLDL è legata a vari fattori come la formazione di aldeidi, la conversione di fosfolipidi a lisofosfolipidi ma, in particolar modo, all’ossidazione del colesterolo ad ossisterolo. Gli ossisteroli maggiormente presenti nelle oxLDL sono il 7-ketocolesterolo (7-KC) e il 7-betaidrossicolesterolo (7-βOHC) (Lizard G et al. 1999).
La prima parte del lavoro, svolto a Padova, ha avuto come obiettivo lo studio degli effetti del 7beta-idrossicolesterolo e del 7-chetocolesterolo sulla sopravvivenza/apoptosi delle cellule endoteliali del cordone ombelicale (HUVEC) e cellule muscolari lisce di aorta di ratto (A7r5).
Il progetto di ricerca, invece, svolto presso il laboratorio del Prof. Dr. Dr. Klaus Aktories a Freiburg (Germania) aveva come obiettivo quello di determinare se il 7beta-idrossicolesterolo e il 7-chetocolesterolo inducevano un’attivazione delle proteine RhoA e Rac e quali effetti potevano avere tali attivazioni sulla funzione cellulare.
I metodi utilizzati per queste ricerche sono stati il Pull-down assay e la microscopia a fluorescenza (F-actin staining e Vinculin staining).
I primi esperimenti sono stati condotti su un modello cellulare in cui risultava facile osservare qualunque modificazione del citoscheletro in seguito a trattamento, le HeLa. In queste cellule il trattamento con entrambi gli ossisteroli (alla concentrazione di 5ug/ml) provocava un’attivazione delle proteine Rac, che era massimale dopo due ore di incubazione, mentre non si notava nessuna attivazione delle proteine Rho A.
Diversamente, nelle A7r5 il pull-down assay non ha evidenziato l’attivazione delle proteine RhoA e Rac. Tuttavia, attraverso la tecnica dell’actin staining è stato possibile osservare che, dopo due ore di trattamento, entrambi gli ossisteroli (5ug/ml e10ug/ml) provocavano la formazione di punti ricchi di F-actina e il cambiamento della morfologia cellulare delle A7r5 che da allungate diventavano rotondeggianti. La colocalizzazione della Vinculina nei punti ricchi di F-actina ( attraverso vinculin staining) ha permesso di caratterizzare queste strutture come podosomi ( strutture simili alle adesioni focali contenenti Talina, Vinculina ed a-actinina, che differiscono dalle adesioni focali in quanto il loro citoscheletro actinico è disorganizzato).
Queste modificazioni del citoscheletro sono molto importanti per la motilità delle cellule e potrebbero indicare come gli ossisteroli siano in qualche modo responsabili della migrazione delle cellule muscolari lisce durante la formazione e sviluppo della placca aterosclerotica.
Pighin Isabella
Dipartimento di Farmacologia ed Anestesiologia
Università di Padova