SOCIETA' ITALIANA DI FARMACOLOGIA
Relazioni dei borsisti sif
RELAZIONE
ATTIVITA’ SCIENTIFICA all'ESTERO
Dott. Eugenio Barone
Institute of Pharmacology Catholic
University School of Medicine
RELAZIONE DELL’ATTIVITA’ DI RICERCA ALL’ESTERO
SVOLTA PRESSO LA UNIVERSITY OF KENTUCKY
NEL LABORATORIO DEL PROF. D. ALLAN BUTTERFIELD
Il lavoro svolto durante il periodo gennaio – novembre 2010 è stato il frutto dell’attività di ricerca condotta nel laboratorio di neurochimica del Department of Chemistry, Center of Membrane Sciences, and Sanders-Brown Center on Aging, University of Kentucky, Lexington, KY, USA diretto dal Prof. D. Allan Butterfield.
Il laboratorio del Prof. Butterfield, è famoso per essere stato il primo al mondo ad usare la tecnica della Redox Proteomica al fine di identificare le modificazioni ossidative a carico di proteine coinvolte nella patogenesi e progressione delle malattie neurodegenerative quali la demenza di Alzheimer (AD) e il mild cognitive impairment (MCI), entrambe caratterizzate da elevati livelli di stress ossidativo e nitrosativo.
Il sistema eme ossigenasi/biliverdina reduttasi (EO/BVR) è la principale via metabolica coinvolta nella degradazione dell’eme. L’EO, di natura microsomiale, catalizza l’ossidazione del ponte metinico in posizione alfa del tetrapirrolo ciclico eme generando biliverdina-IX-alfa (BV) con formazione, in quantità equimolari, di monossido di carbonio e ione ferroso. A sua volta la BV viene trasformata dall’enzima citosolico BVR in bilirubina (BR). Per molti anni il sistema EO/BVR è stato considerato funzionale al solo catabolismo dei gruppi eme presenti nelle emoproteine, ma negli ultimi due decenni un numero sempre maggiore di evidenze sperimentali ha messo in luce le sue funzioni biologiche, tra cui l’ attività di degradazione dell’eme, pro-ossidante in caso di alterazioni redox a carico della cellule nervose, e di chain-breaker della BRche ne fa uno degli antiossidanti più efficaci a livello cellulare. Queste caratteristiche hanno reso il sistema EO/BVR un target molto interessante, soprattutto riguardo al ruolo neuroprotettivo in caso di malattie neurodegenerative quali la demenza di Alzheimer.
Nonostante le numerose evidenze sperimentali riguardo il ruolo protettivo di EO nella risposta cellulare allo stress da radicali liberi, come durante la patogenesi di AD ed MCI, poche notizie esistono riguardo l’altro, e non meno importante, attore di tutto il sistema: l’enzima biliverdina reduttasi. L’importanza della caratterizzazione di queste due proteine risiede nel fatto che la mancanza o il malfunzionamento di una delle due implica uno sbilanciamento nell’attività di tutto il sistema.
Il lavoro di ricerca, che qui cercherò di riassumere, è stato ripartito tra tre grandi progetti:
- Modificazioni ossidative dell’EO e della BVR nell’AD e nel MCI;
- Coinvolgimento del sistema EO/BVR nella protezione indotta dalla somministrazione cronica di atorvastatina in cani beagle anziani, attualmente il miglior modello preclinico di AD;
- Modulazione del sistema EO/BVR nel cervello di topi resi transgenici per p53, MnSOD o entrambe.
Progetto 1
Uno degli obiettivi raggiunti in questo anno è stato quello di caratterizzare le modificazioni ossidative che avvengono a carico dell’isoforma inducibile di EO (EO-1) e della BVR durante la progressione dell’AD o del MCI. A tale scopo, campioni di ippocampo e cervelletto uman, differentemente coinvolti nella progressione dell’AD o del MCI, sono stati analizzati per valutare l’eventuale compromissione di EO e BVR secondaria ai processi ossidativi che colpiscono queste regioni cerebrali nel corso AD e MCI. Con tecniche di immunoprecipitazione e Western Blot per mezzo di anticorpi specifici, sono state valutate modifiche post-traduzionali di tipo ossidativo [carbonili proteici (PC) ed addotti con 4-idrossi-2-nonenali (HNE)], nitrosativo [3-nitrotirosina (3-NT)] a carico di EO-1 e BVR. Sono stati, inoltre, misurati i livelli di fosforilazione su residui di serina/treonina/tirosina (Ser/Thr/Tyr) su EO-1 e BVR. I risultati di questo studio hanno mostrato come, nell’ippocampo, sia l’EO-1 che la BVR sono oggetto delle modificazioni ossidative che avvengono nell’AD e nel MCI. In particolare, mentre l’EO-1, di origine microsomiale, è maggiormente modificata da parte degli HNE, la BVR, citosolica, è caratterizzata da un elevato livello di 3-NT sia nell’AD che nel MCI. Allo stesso tempo, nell’ippocampo dei pazienti con AD o MCI, l’EO-1 presentava un aumento dei livelli di fosforilazione su residui di serina, mentre la BVR era caratterizzata da una diminuzione della fosforilazione a livello dei residui di serina, treonina e tirosina. Di particolare interesse, nel caso della BVR, è stata la scoperta che, nell’ippocampo dei pazienti affetti da AD o MCI, a fronte di un aumento dei livelli di espressione totale della proteina, l’attività risultava essere diminuita. La causa di questa diminuzione è stata attribuita in particolar modo all’aumento della nitrazione, nonché alla diminuzione dei livelli di fosforilazione dell’enzima, che come già dimostrato da altri studi presenti in letteratura, sono necessarie per la sua attività. Al contrario, per quanto riguarda il cervelletto, essendo quest’ultimo una regione cerebrale scarsamente coinvolta nella progressione dell’AD, i risultati hanno mostrato che non esistono variazioni sostanziali a carico del sistema EO/BVR. Queste evidenze sperimentali, aprono una nuova strada, nella valutazione del sistema EO/BVR, poiché per la prima volta è stato dimostrato che la valutazione dei soli livelli di espressione totale di EO-1 e BVR, non è sufficiente per spiegare il possibile ruolo protettivo del sistema nelle malattie neurodegenerative.
Progetto 2
In seguito alla scoperta che il sistema EO/BVR era compromesso dall’aumento dei livelli di stress ossidativo nel cervello di pazienti affetti da AD o MCI, e del dato clinico che l’atorvastatina ha avuto un qualche ruolo neuroprotettivo in pazienti con AD (studio LEADe), si è deciso di valutare se il ruolo terapeutico della statina potesse essere secondario alla riduzione del flusso ossidativo/nitrosativo nel cervello di questi pazienti. I cani beagle, rappresentano un ottimo modello pre-clinico per lo studio dell’AD per i seguenti motivi: a) sviluppano naturalmente depositi di proteina beta-amilode con l’età; b) la struttura della proteina beta-amiloide è identica a quella umana; c) con l’età sviluppano deficit cognitivi nelle stesse regioni cerebrali coinvolte dallo stesso processo nell’uomo. Inoltre, la risposta, i meccanismi di tolleranza e gli effetti avversi, che si sviluppano in seguito alla somministrazione di una data classe di farmaci sono simili a quelli umani. Per tutte queste ragioni, i beagle anziani, si presentano come un modello utile per valutare gli effetti di un trattamento cronico con le statine. Per quanto riguarda il trattamento, questi cani, la cui età era compresa tra gli 8.9 e i 13.2 anni, in seguito ai punteggi ottenuti dopo aver superato alcuni test cognitivi, sono stati suddivisi in due gruppi equivalenti che comprendevano 2 maschi e 4 femmine. Un gruppo ha ricevuto atorvastatina 80 mg/die per la durata di 14.5 mesi, mentre l’altro gruppo (controllo) ha ricevuto il placebo. Numerosi parametri sia biologici che cognitivi, sono stati analizzati durante l’arco del trattamento. Dopo l’eutanasia, gli organi sono stati prelevati per l’analisi sperimentale.
I risultati ottenuti da questo studio dimostrano come, in seguito alla somministrazione di atorvastatina, si verifichi un aumento significativo dei livelli di espressione sia di EO-1 che BVR nella sola corteccia parietale, mentre non ci sono variazioni significative per EO-2 e iNOS. Allo stesso tempo nel cervelletto si ha un aumento significativo rispetto al controllo della sola EO-2. Al fine di valutare se l’aumento dell’espressione della BVR, fosse accompagnato o meno da modificazioni ossidative e/o fosforilative che ne compromettessero la funzionalità, i livelli di PC, HNE, e 3-NT, nonché il grado di fosforilazione dei residui di Ser/Thr/Tyr a livello della proteina sono stati analizzati. I nostri dati dimostrano chiaramente come in seguito al trattamento con atorvastatina, nella corteccia parietale si verifica una diminuzione della nitrazione dell’enzima BVR accompagnata da una aumento della fosforilazione su Ser/Thr/Tyr. L’analisi dell’attività dell’enzima ha poi dimostrato come, nei cani beagle trattati con atorvastatina, a fronte della concomitante diminuzione della nitrazione e dell’aumentata fosforilazione, ci sia un aumento dell’attività della BVR. I livelli di espressione di EO-1 e BVR nella corteccia parietale, nonché il grado di fosforilazione e nitrazione della BVR, sono stati in seguito correlati con i dati relativi ai test cognitivi effettuati su questi cani. Con grande sorpresa, i nostri risultati hanno dimostrato come, in seguito alla somministrazione di atorvastatina, il miglioramento della capicità di discriminazione ottenuto su questi animali fosse positivamente correlato con l’aumento dei livelli di espressione sia dell’HO-1 che della BVR.
Progetto 3
Diversi studi in letteratura, hanno dimostrato come le proteine p53 e MnSOD rivestano un ruolo importante, nella modulazione della risposta cellulare allo stress. Inoltre sembra che sia proprio l’equilibrio esistente tra l’attività di queste due proteine a controllare processi quali il differenziamento cellulare, la risposta allo stress e l’apoptosi. Nonostante, si conoscano già numerosi geni, la cui induzione è sotto il controllo diretto di p53, MnSOD o entrambe, nulla si sa riguardo alla possibilità che queste due proteine possano essere coinvolte nella modulazione del sistema EO/BVR durante la risposta cellulare allo stress da radicali liberi. Per questo motivo, topi knock-out per p53 (p53 -/-), e transgenici per MnSOD (MnSOD -/+; MnSOD ++) o per entrambe (p53 -/- MnSOD -/+ e p53-/- MnSOD ++) sono stati utilizzati per valutare lo stress ossidativo e l’espressione di proteine stress-indotte, in particolare il sistema EO/BVR a livello cerebrale.
I risultati ottenuti hanno dimostrato come la presenza o l’assenza di p53 e/o MnSOD siano responsabili del differente grado di di stress ossidativo a carico di citoplasma, mitocondri e nucleo. Allo stesso tempo, il sistema EO/BVR risulta essere differentemente modulato dalla presenza o dall’assenza di p53 o MnSOD. In particolare, in assenza di p53 (gruppo p53 -/-) si ha un aumento significativo della BVR cerebrale e una tendenza all’aumento dell’EO-1 rispetto al gruppo di controllo. Nei topi che presentavano una down-regulation eterozigote della MnSOD (MnSOD -/+) l’ espressione della BVR non cambiava mentre quelli di EO-1 erano significativamente diminuiti rispetto al controllo. Nel gruppo con una over-epressione dell’enzima MnSOD (MnSOD ++) non vi erano modificazione significative siadi EO-1 che di BVR. Infine, mentre nel gruppo di topi p53 -/- MnSOD -/+ si aveva un aumento significativo dell’espressione della BVR ed un leggero aumento di quella di EO-1, nel gruppo p53 -/- MnSOD ++ , si verificava l’effetto contrario, ossia una diminuzione significativa dell’espressione della BVR accompagnata da livelli di espressione dell’EO-1 simili a quelli del gruppo di controllo. Ovviamente, la valutazione dei soli livelli di espressione, non ci ha consentito di determinare un preciso meccanismo d’azione, ma solo di speculare riguardo al coinvolgimento o meno delle proteine sopra menzionate. Ulteriori studi, saranno necessari, per identificare i processi che stanno alla base dei nostri risultati.