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SOCIETA' ITALIANA DI FARMACOLOGIA
Relazioni dei borsisti sif

RELAZIONE ATTIVITA’ SCIENTIFICA
LUGLIO – SETTEMBRE 2007
Dott.ssa Mariantonella Colucci
Dipartimento del Farmaco
Istituto Superiore di Sanità (ISS)

Introduzione

Attualmente il trattamento farmacologico del dolore prevede l’utilizzo di due categorie di farmaci analgesici: inibitori della sintesi di prostaglandine (farmaci antinfiammatori non steroidei)1 ed oppioidi2. Tuttavia è noto come sia l’utilizzo che l’efficacia di questi farmaci siano spesso influenzati dagli effetti collaterali da essi prodotti3-4. Per questo motivo, si rende necessaria la ricerca di classi di farmaci nuove o alternative che presentino elevata efficacia nel trattamento del dolore sia acuto che cronico e che presentino effetti collaterali nulli o trascurabili.

In tal senso, presso il Laboratorio diretto dal prof. Vittorio Dal Piaz, Professore Ordinario di Chimica Farmaceutica presso l’Università di Firenze, sono stati effettuati importanti e promettenti studi finalizzati alla progettazione e alla sintesi di derivati piridazinonici ad azione analgesica5-8, poiché è noto che alcuni composti piridazinici come l’emorfazone presentano interessanti proprietà antinocicettive, pur non agendo sulle vie di modulazione del dolore regolate dai suddetti farmaci analgesici9. In particolare, questi studi hanno dimostrato che alcuni derivati piridazinonici con una sottostruttura arilpiperazinilica presentano elevata potenza ed efficacia antinocicettiva agli stimoli termici10.

Durante questo periodo abbiamo dunque approfondito le nostre ricerche su una serie di molecole analoghe ai suddetti derivati piridazinonici. Questi composti, sintetizzati dal prof Dal Piaz e definiti ET, sono stati studiati per la loro potenziale azione antinocicettiva mediante i saggi della piastra calda (hot plate test) e dello scatto della coda (tail flick test), per la valutazione degli effetti sul dolore provocato da stimoli termici.

Materiali e metodi

Gli studi in vivo venivano effettuati su topi CD1 (maschi adulti del peso di 25-30 g), sacrificati mediante dislocazione cervicale dopo ogni esperimento.

Per le somministrazioni intracerebroventricolari (i.c.v.), gli animali venivano anestetizzati con ketamina/xilazina alla dose di (80 mg ketamina + 10 mg xilazina)/kg di peso corporeo ed operati secondo il metodo descritto da Porreca et al. (1984)11, che consiste nell’effettuare un foro nel cranio all’altezza del ventricolo destro (identificato in base alle coordinate stereotassiche del cranio dei topi CD1), senza applicare alcuna cannula. Dopo l’operazione, gli animali venivano lasciati recuperare per 2 giorni, e quindi utilizzati per gli esperimenti.

Nel caso delle somministrazioni intraperitoneali, (i.p.) o intraplantari (i.pl.), gli animali venivano trattati mediante l’utilizzo di aghi da 27G, mentre nel caso della somministrazione per via orale, sono stati utilizzati degli opportuni sondini gastrici.

I composti ET venivano disciolti in DMSO in modo da ottenere soluzioni concentrate che venivano opportunamente diluite con DMSO/salina 1:3 alle dosi utilizzate per gli esperimenti.

I topi di controllo venivano trattati solo con il veicolo, ossia DMSO/salina 1:3.

Gli effetti di ET1 e di ET14 sono stati valutati mediante i tests di nocicezione termica (hot plate e tail flick) e mediante un test di nocicezione chimica (test della formalina). I primi due saggi consistono nella misurazione dei tempi di latenza (in secondi) con cui l’animale reagisce allo stimolo termico nocicettivo. Per il test del hot plate abbiamo fissato i seguenti parametri: 48,5 °C e cut off di 60 sec, con valutazione dello scuotimento o del leccamento delle zampe o di altre parti del corpo. Per il test del tail flick i parametri sono: 15 V di calore radiante e cut off di 15 sec, con valutazione dello scatto della coda. Inizialmente i topi venivano sottoposti a tre misurazioni di base, in modo da essere adattati alla manipolazione e agli apparecchi. In questi saggi, i dati venivano raccolti ad intervalli di 15, 30, 45, 60, 90 e 120 min, sia in seguito a somministrazione i.c.v. (5 μl/topo), che dopo somministrazione per os (μg/kg in volumi di 10ml/kg).

Nel caso del saggio della formalina, gli animali venivano adattati isolandoli per circa 1 ora, con cibo ed acqua ad libitum. Dopo di che si procedeva alla somministrazione i.c.v. del composto ET in esame (5 μl/topo, 10 min prima della formalina), quindi si somministrava per via intraplantare (i.pl.) la formalina al 5 % in soluzione salina (20 μl/zampa). La formalina genera una forte reazione nocicettiva che induce l’animale a mettere in atto una serie di comportamenti nocifensivi tra cui il leccamento della zampa; l’andamento temporale di tale reazione è tipicamente bifasica, con una prima fase di nocicezione nei primi 10 minuti e una seconda fase tra 10 e 40 minuti. Il nostro protocollo sperimentale prevedeva la valutazione dei tempi (sec) di leccamento della zampa trattata con formalina per i 40 minuti successivi alla somministrazione i. pl.

Risultati

I risultati precedenti avevano dimostrato che solo i composti ET 1, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 e 13, in seguito a somministrazione centrale, aumentano significativamente la soglia nocicettiva al calore radiante, con un picco di analgesia tra 15-30 minuti dalla somministrazione i.c.v

Al test del hot plate, i dati raccolti sembrano confermare quanto osservato nel caso del test del tail flick, sebbene con minore chiarezza.

Tali dati hanno inoltre dimostrato che, tra i suddetti composti attivi, ET1 sembra essere il più efficace, perciò abbiamo valutato gli effetti prodotti dalla somministrazione orale (per os) di dosi crescenti di questo prodotto. I risultati dimostrano che ET1, a partire dalla dose di 10 mg/kg, aumenta la latenza di risposta nocicettiva al calore termico, mentre al test del tail flick ET1 è già efficace alla dose di 1 mg/kg. In entrambi i casi l’andamento temporale dell’effetto analgesico presenta un picco dopo 15 minuti dalla somministrazione, per poi tendere di nuovo ai livelli di base dopo circa 90 minuti.

Successivamente si è passati alla valutazione dei potenziali effetti antiinfiammatori dei prodotti ET, dimostrando che la somministrazione centrale di ET1 (da 10 μg/topo) diminuisce significativamente sia la prima che la seconda fase di nocicezione indotta dalla somministrazione i.pl. di formalina.

Allo scopo di individuare un possibile meccanismo d’azione di ET1, abbiamo verificato se gli effetti indotti da ET1 potessero essere mediati dall’attivazione dei recettori nicotinici per l’ACh, poiché ET1 presenta delle importanti similitudini strutturali con l’epibatidina, un agonista di questi recettori e di cui è nota la potente azione analgesica12. Per fare ciò, abbiamo utilizzato la mecamilamina, un antagonista non competitivo dei recettori nAChR selettivo per i sottotipi neuronali. I dati ottenuti dimostrano che il pretrattamento per via intraperitoneale (i.p.) con la mecamilamina (5 mg/kg, 30 min prima) tendenzialmente riduce l’analgesia indotta dalla somministrazione i.c.v. di ET1 10 mg/kg al test del tail flick, mentre potenzia l’effetto di ET1 al test del hot plate. Tale riduzione al test del tail flick risulta significativa quando viene somministrato i.c.v. ET1 50 mg/kg in seguito alla somministrazione i.p. di mecamilamina (sempre 5 mg/kg, 30 min prima).

Il pretrattamento i.p. con mecamilamina alla dose di 1 mg/kg (30 minuti prima) abolisce l’effetto analgesico prodotto dalla somministrazione orale di ET1 1 mg/kg.

A questo punto abbiamo verificato se gli effetti indotti da ET1 potessero essere mediati anche dall’attivazione del sistema noradrenergico che, come noto, svolge un ruolo cruciale nella trasmissione e nell’elaborazione degli stimoli nocicettivi. I dati hanno dimostrato che il pretrattamento i.p. con yoimbina (da 0.2 a 5 mg/kg, 15 minuti prima) riduce in maniera dose-dipendente l’effetto analgesico prodotto dalla somministrazione orale di ET1 1 mg/kg.

Conclusioni

I risultati presentati permettono dunque di concludere che:

  • Il gruppo metilico in posizione 6 del nucleo piridazinonico risulta essere utile, ma non indispensabile per l’attività antinocicettiva
  • Il gruppo vinilico in posizione 5 del piridazinone è di fondamentale importanza per l’attività analgesica
  • L’allungamento dello spaziatore da gruppo etilico a propilico e la sostituzione del metile in posizione para della catena arilalchilpiperazinica con un atomo di cloro aumentano l’attività analgesica di questi composti

In particolare, dai dati si evince che ET1 presenta interessanti proprietà antinocicettive, sia in seguito a somministrazione centrale che per via orale e che tale attività antinocicettiva coinvolge almeno il sistema nicotinico e il sistema noradrenergico.

Inoltre, gli effetti analgesici prodotti da ET1 sulla seconda fase di nocicezione indotta da formalina fanno supporre che questo composto possa presentare anche buone proprietà antinfiammatorie

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Dott.ssa Mariantonella Colucci
Dipartimento del Farmaco
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