SOCIETA' ITALIANA DI FARMACOLOGIA
Relazioni dei borsisti sif
RELAZIONE
ATTIVITA’ SCIENTIFICA all'ESTERO
Dott.ssa Alice De Corato
Università Cattolica del Sacro Cuore
Roma
RELAZIONE SULL'ATTIVITA' DI RICERCA ALL'ESTERO (Giugno-Dicembre 2010)
SVOLTA PRESSO IL DIPARTIMENTO DI ANESTESIOLOGIA
DELLA "UNIVERSITY OF CALIFORNIA SAN DIEGO"
Il laboratorio del Dipartimento di Anestesiologia dell’Università della California (San Diego) si occupa principalmente dello studio del dolore neuropatico cronico mediante modelli in vivo ed in vitro.
Il dolore neuropatico è il risultato di lesioni o di malattie che colpiscono il sistema nervoso somato-sensoriale periferico o centrale. Clinicamente, è caratterizzato da episodi dolorosi ad insorgenza spontanea e da un'aumentata sensibilità e risposta a stimoli nocicettivi e non (iperalgesia e allodinia). La ricerca di base, in questo campo, sta permettendo di identificare alcuni dei meccanismi fisiopatologici che sono alla base del dolore neuropatico, ma molti sono ancora gli aspetti che necessitano di essere chiariti. In tale ambito, risulta di particolare interesse l'individuazione di nuovi potenziali target farmacologici, al fine di rendere possibile un intervento terapeutico integrato e di migliore efficacia.
Le cellule di Schwann, con i loro recettori ed i pathway di trasduzione del segnale, rivestono un ruolo centrale per la comprensione dei meccanismi cellulari e molecolari che regolano la risposta al danno del tessuto nervoso periferico. Tali cellule, infatti, a seguito di un danno neuropatico, subiscono dei cambiamenti fenotipici drammatici, acquisendo la capacità di proliferare, migrare e secernere numerosi fattori che regolano la degenerazione Walleriana e la rigenerazione del nervo. Il recettore LRP1 (low density lipoprotein receptor-related protein) è stato di recente individuato come un nuovo ed importante regolatore della risposta di queste cellule al danno neuropatico periferico, in quanto responsabile dell’attivazione di importanti vie di signaling cellulare. Tale recettore, inoltre, sembra avere un ruolo essenziale per la sopravvivenza delle cellule di Schwann dopo il danno neuropatico. La ricerca presso il laboratorio dell'Università ospitante è fortemente incentrata sulla comprensione dei meccanismi tramite i quali il recettore LRP1 regola la risposta al danno periferico ed al dolore neuropatico cronico.
Nel corso del mio periodo di training presso il laboratorio dell'Università di San Diego ho avuto la possibilità di ampliare le mie conoscenze riguardanti i meccanismi fisiopatologici del dolore. In particolare, il mio progetto di Dottorato, finora prevalentemente incentrato sullo studio del dolore nocicettivo, è in corso di ampliamento, grazie alla possibilità di effettuare studi riguardanti il dolore neuropatico. Nello specifico, in questi mesi ho preso parte ad un progetto riguardante dei topi knock-out condizionali per il recettore LRP1 nelle cellule di Schwann. Gli obiettivi del progetto di ricerca sono: 1) determinare come il recettore LRP1 regoli la risposta al danno nel sistema nervoso periferico e negli stati dolorosi cronici correlati; 2) valutare se tale recettore abbia un ruolo anti-infiammatorio e/o neuro protettivo per trattamento del dolore cronico.
Negli esperimenti su questi topi geneticamente modificati, ho appreso ed utilizzato due ben noti modelli di dolore neuropatico e degenerazione Walleriana: il Seltzer model (legatura parziale del nervo sciatico) ed il crush injury model (danno da schiacciamento) rispettivamente.
La legatura parziale del nervo sciatico (PSL) prevede l’esposizione del nervo sciatico nella coscia superiore e la legatura con un filo di seta 8.0 in modo tale che 1/3-1/2 dello spessore del nervo sia stretto nella legatura. Il PSL è stato scelto come modello di dolore neuropatico in quanto induce una risposta dolorosa di moderata entità che tende a migliorare, fino alla scomparsa, dopo due settimane nei topi normali. A seguito della legatura del nervo e per almeno 2 settimane a partire dall’operazione chirurgica, gli animali sono stati sottoposti a test comportamentali (Von Fray filament e rotarod) per valutare l'eventuale differenza nella risposta tra l'animale wild-type e quello knock-out. Il test che utilizza i filamenti Von Fray permette di determinare la presenza di allodinia meccanica utilizzando filamenti numerati di diversa rigidità, che imprimono una forza incrementale secondo una scala logaritmica. Tali filamenti vengono applicati sulla superficie plantare della zampa posteriore sede dell’operazione chirurgica per 3-5 secondi. Tramite il metodo “up-down” e con successivi calcoli, è possibile ottenere il valore soglia di withdrawal. Da questo test è risultato che i topi con delezione condizionale del recettore LRP1 nelle cellule di Schwann hanno una soglia di withdrawal più bassa rispetto ai topi wild type, ovvero sviluppano un’allodinia meccanica più intensa che non migliora durante le 2 settimane del test.
Il test per valutare la presenza di eventuali disfunzioni motorie (rotarod) non ha evidenziato differenze tra i due gruppi sperimentali.
Il crush injury model è un noto modello sperimentale di degenerazione Walleriana, grazie al quale è possibile riprodurre le tappe di questa complessa serie di eventi. Il nervo sciatico viene esposto a livello della parte prossimale della coscia e, mediante una pinza, viene compresso per 30 secondi (crush). Immediatamente dopo il danno, il nervo appare assottigliato sul sito del crush, ma l’integrità del nervo è mantenuta. Tale modello è stato utilizzato per studiare l’andamento della degenerazione Walleriana negli stadi più precoci susseguenti il danno. Il tessuto nervoso, prelevato distalmente rispetto al sito del crush con una lunghezza costante di 0.5 cm, è stato processato in maniera differente a seconda del tipo di esperimento da effettuare (TUNEL, qPCR, tecniche istologiche).
Poiché è noto che, in seguito a danno neuropatico, il recettore LRP1 viene up-regolato nelle cellule di Schwann promuovendone la sopravvivenza, è stato effettuato un TUNEL assay su sezione trasversale di nervo sciatico, 24 ore dopo il crush injury. Il TUNEL è un metodo che permette di identificare, mediante una sonda fluorescente, la frammentazione del DNA che risulta dalla complessa cascata di eventi che portano all’apoptosi. Nell’esperimento condotto, il nervo sciatico del topo knock-out è risultato positivo (presenza di cellule apoptotiche), mentre nella sezione di nervo del topo wild-type la fluorescenza era scarsamente rilevabile.
Per gli esperimenti di qPCR, sono stati prelevati i nervi dopo 1, 2 e 3 giorni a partire dal giorno del crush. L’RNA estratto dal nervo in toto è stato retro-trascritto ed il cDNA utilizzato per l’analisi dell’espressione genica di LRP1, MMP9 (matrix metallopeptidase 9) e TNFα (tumor necrosis factor α). I risultati ottenuti sull’analisi dell’espressione di LRP1 hanno dimostrato e confermato la delezione del recettore sui topi geneticamente modificati rispetto a quelli wild-type. L’espressione della proteina MMP9 mostra una tendenza all’aumento nei tre giorni successivi al crush, ma i suoi livelli risultano essere costantemente inferiori nei topi knock out rispetto ai wild-type. Stessa differenza tra i due gruppi di animali è stata riscontrata per TNF α solo a 24 ore dal crush injury, mentre nei giorni successivi non si evidenzia alcuna differenza significativa.
Tecniche istologiche sono state utilizzate per l’analisi microscopica della struttura del nervo. Il tessuto è stato fissato e incluso in materiale resinoso plastico per ottenere sezioni trasversali del nervo con la massima conservazione della struttura. L’analisi al microscopio dei nervi, raccolti a vari time point dal giorno del crush injury, ha permesso di evidenziare la patologia degenerativa in atto. In particolare, i topi knock out mostravano una degenerazione ed un’alterazione strutturale del nervo più accelerata e pronunciata rispetto al gruppo di controllo. Tale aspetto è stato evidenziato anche mediante immunostaining del tessuto (incluso in paraffina) con MBP (myelin basic protein). Tale proteina è una delle principali componenti della guaina mielinica, prodotta dalle cellule di Schwann, che riveste le fibre nervose. In seguito al danno neuropatico, le cellule di Schwann perdono il rivestimento mielinico e la mielina si disgrega. La rapidità di rigenerazione del nervo dipende soprattutto dalla rapidità con cui i detriti di mielina vengono rimossi, processo cui prendono parte attivamente le cellule di Schwann ed i macrofagi infiltranti in una fase successiva. Lo staining del tessuto con MBP ha mostrato come la mielina che riveste le fibre nervose nei nervi dei topi con delezione di LRP1 sia altamente destrutturata rispetto al gruppo di controllo.
I dati fin qui raccolti mediante questo modello sperimentale di delezione condizionale del recettore LRP1 nelle cellule di Schwann mostrano che tale recettore è un importante regolatore della degenerazione nervosa e del dolore cronico che risultano da un danno. Ulteriori esperimenti sono necessari per comprendere i meccanismi che sono alla base di tale regolazione, permettendo così di ottenere un razionale per lo sviluppo di strategie anti-infiammatorie e neuro-protettive che impediscano l’instaurarsi e il mantenimento del dolore neuropatico cronico, tenuto conto del fatto che, attualmente, non esistono farmaci efficaci per il trattamento di tale patologia che siano anche esenti da effetti collaterali seri.