SOCIETA' ITALIANA DI FARMACOLOGIA
Relazioni dei borsisti sif
RELAZIONE
ATTIVITA’ SCIENTIFICA all'ESTERO
Dott.ssa Catia Giordano
RELAZIONE SULL'ATTIVITA' DI RICERCA ALL'ESTERO
SVOLTA PRESSO IL DIPARTIMENTO DI PATOLOGIA
DELL’UNIVERSITA’ DELL’ALABAMA A BIRMINGHAM (UAB) - USA
“TRAUMATIC BRAIN INJURY E AUTOFAGIA”
Il Traumatic Brain Injury (TBI) rappresenta una delle principali cause di mortalità ed invalidità per milioni di soggetti in tutto il mondo, spesso accompagnato da problemi neurologici e psicologici e può portare a morte cellulare nell’arco di giorni o settimane (Raghupathi et al,2003; Sudasivan et al., 2008; Thranian et al., 2008)
L’autofagia regola il turnover fisiologico di componenti cellulari, come i macronutrienti e gli organelli danneggiati, attraverso l’attività degradativa lisosomiale. In base al modo con cui il materiale da degradare viene trasportato all’interno del lume lisosomiale, per il tipo di materiale trasportato e per il loro meccanismo di regolazione, si distinguono tre tipi di autofagia (Shacka et al., 2008):
- la macroautofagia rappresenta la principale forma di autofagia, consiste nel sequestro di porzioni di citoplasma all’interno di vacuoli a doppia membrana (autofagosoma), destinati a fondersi con i lisosomi per formare gli autofagolisosomi, all’interno dei quali gli enzimi litici lisosomiali provvedono alla degradazione del contenuto;
- la microautofagia è coinvolta nell’inglobamento e degradazione di regioni citoplasmatiche direttamente da parte dei lisosomi, attraverso un sistema di invaginazioni ed evaginazioni tubuliformi della propria membrana, senza richiedere la formazione dei vacuoli;
- l’autofagia chaperone-mediata (CMA) è caratterizzata da proteine bersaglio recanti una specifica sequenza pentapeptidica (KFERQ) che vengono riconosciute e legate da chaperonine citosoliche (es. la proteina heat shock di 70 kDa o hsc70) che le trasporta sulle membrane lisosomiali. Qui il complesso chaperonina-proteina viene riconosciuto e legato da specifici recettori lisosomiali (es. LAMP-2) e con l’intervento di altre chaperonine, localizzate all’interno dei lisosomi, le proteine-bersaglio vengono traslocate attraverso la membrana all’interno del lume lisosomiale, dove vengono degradate.
L’induzione o inibizione dell’autofagia induce uno stato di stress autofagico, che può causare morte cellulare programmata (Programmed Cell Death, PCD) sia di tipo apoptotica che non apoptotica (Hatton, 2001; Shacka et al., 2006). Lo stress autofagico risulta in un accumulo di vacuoli autofagici (AV) identificabili morfologicamente e biochimicamente attraverso un aumento dei livelli di LC3-II (microtubule associated protein light chain-3 II, marker AV), il frammento di 14 kDa di LC3 che è associato specificatamente alla membrana dell’autofagosoma (Kabeya et al., 2000; Koike et al., 2005). LC3 nei mammiferi è omologo all’Atg8 (autophagy-related 8) del lievito ed intereargisce con la membrana dell’autofagosoma in maniera Atg5-dipendente, rimanendo sulla membrana dopo la dissociazione del complesso Atg12-Atg5 (importante per la formazione dell’autofagosoma). Fino ad oggi il ruolo dello stress autofagico nel TBI è sconosciuto, ma la sua esistenza in altri modelli di danno del sistema nervoso centrale, suggerisce un suo potenziale ruolo nel Traumatic Brain Injury. Diversi studi hanno mostrato che l’autofagia può essere indotta attraverso un meccanismo p53-dipendente (Feng et al., 2005; Maclean et al., 2008) che può essere trascritto-dipendente (ad esempio attivazione di AMPK) o trascritto-indipendente (per esempio upregulation degli inibitori di mTOR come PTEN, phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome ten e upregulation di DRAM, damage-regulated autophagy modulator) (Levine e Abrams, 2008) e recentemente è stato dimostrato un aumento dei livelli di mRNA di p53 in regioni del cervello danneggiati da TBI (Napieralski et al., 1999).
Partendo da questa premessa, lo scopo del mio lavoro è stato quello di definire mediante l’utilizzo di modelli in vivo ed in vitro, la regolazione molecolare del pathway di degradazione autofagico-lisosomiale (Autophagy-Lysosome degradation Pathways, ALP) in seguito a Traumatic Brain Injury ed il suo potenziale link con la morte neuronale, con particolare riferimento al pathway p53.
Negli esperimenti in vivo sono stati utilizzati topi geneticamente modificati, knockout per il gene bax, al fine di valutare se lo stress autofagico (PCD di tipo II) indotto, persisteva nei topi TBI anche in assenza di apoptosi (PCD di tipo I). Il modello di TBI utilizzato nel presente studio è stato il Lateral Fluid Percussion (Carbonelle et al., 1998). In breve, dopo che il cervello e la dura madre sono stati esposti mediante craniotomia, una cannula è stata attaccata al cranio ed un moderato livello di danno è stato indotto collegando il topo anestetizzato al dispositivo da fluid percussion. Dopo 24 ore dall’induzione del TBI i topi sono stati eutanizzati ed i cervelli sono stati prelevati per studi immunoistochimici e di western blotting.
Per studi in vitro sono state utilizzate colture di cellule differenziate di neuroblastomi umani (SH-SY5Y) che sono state danneggiate usando il modello meccanico di stretch injury (Cell Injury Controller II). Questo modello consiste nel coltivare le cellule in pozzetti, il cui fondo è costituito una membrana elastica deformabile. Il dispositivo regola il flusso di gas (e di conseguenza il livello di danno) compressa che rapidamente pressurizza ciascuna coltura posizionata nei pozzetti causandone streatch injury visibile mediante la deformazione della membrana e delle cellule. Nel presente studio le cellule sono state sottoposte ad una basso, moderato e alto livello di stretch injury e dopo 24 ore dall’induzione del danno sono state processate per ottenere lisati da utilizzare per esperimenti di western blotting.
Studi in vivo hanno evidenziato un aumento dei livelli proteici di LC3 (nell’ippocampo), Atg5 e p53 (nella corteccia e nell’ippocampo) in topi knockout per bax, ipsilateralmente alla lesione, senza alcuna variazione di DRAM, PTEN e Cathepsin D. Ed è stato osservato anche un aumento dei livelli proteici di LC3 (ippocampo) in topi eterozigoti. Inoltre studi morfologici hanno evidenziato un’aumento dell’immunomarcatura della forma clivata della caspasi 3 a livello della corteccia di topi TBI, ipsilateralmente alla lesione e della cathepsin D sia a livello della corteccia che dell’ippocampo, sempre ipsilateralmente alla lesione. Studi in vitro, mediante western blot, hanno evidenziato che il danno cellulare indotto da stretch injury ha aumentato in maniera dose-dipendente sia l’accumulo dei vacuoli autofagici (LC3, marker autofagico) che la forma clivata della Caspasi-3 (marker apoptotico).
In conclusione i risultati ottenuti dai modelli in vivo ed in vitro di TBI hanno evidenziato un induzione dello stress autofagico contemporaneamente con i marcatori della morte cellulare. Inoltre è stato osservato che in topi knockout per bax si ha un aumento di Atg5 e p53 suggerendo che, in questo modello, l’autofagia è regolata da p53 in maniera bax-dipendente . Ulteriori studi saranno svolti per valutare in diversi modelli in vivo ed in vitro di TBI la possibile regolazione da parte di p53 della morte cellulare autofagica.
Bibliografia
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Feng Z, Zhang H, Levine AJ, Jin S. The coordinate regulation of the p53 and mTOR pathways in cells. Proc Natl Acad Sci U S A 2005; 102 (23) : 8204-9
Hatton J. Pharmacological treatment of traumatic brain injury: a review of agents in development CNS. Drugs 2001; 15: 553-581.
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Napieralski JA, Raghupathi R, McIntosh TK. The tumor-suppressor gene, p53, is induced in injured brain regions following experimental traumatic brain injury. Brain Res Mol Brain Res (1999); 71(1):78-86.
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Thranian et al. Disruption of Bax Protein Prevents Neuronal Cell Death but Produces Cognitive Impairment in Mice following Traumatic. Brain Injury. J Neurotrauma 2008. 25(7):755-67.