SOCIETA' ITALIANA DI FARMACOLOGIA
Relazioni dei borsisti sif

RELAZIONE DELL’ATTIVITA’ DI RICERCA ALL’ESTERO
SVOLTA PRESSO L’”INSTITUTE OF CHILD HEALTH” DI LONDRA (UK)
NEL LABORATORIO DEL DOTT. ARTURO SALA

(Gennaio – Aprile 2010) - Dott.ssa Ilaria Gnemmi

Il neuroblastoma rappresenta circa il 10% dei tumori pediatrici e l’80% di quelli dei bambini al di sotto dei 5 anni, costituendo il più rilevante tumore solido in questa fascia di età (Brossard et al., 1996).
Il neuroblastoma origina dalle cellule embrionali implicate nello sviluppo del sistema nervoso simpatico che hanno perso la loro capacità di differenziarsi in cellule mature (Brodeur, 2003).
La localizzazione più frequente di questo tumore è l’addome, ma altre sedi che possono essere colpite sono il torace, il collo e il bacino.
Nonostante le varie possibilità terapeutiche (chemioterapia multipla, radioterapia..) apportino miglioramenti alla vita dei pazienti affetti da neuroblastoma, ciascuna di queste comporta anche l’insorgenza di tossicità a lungo o breve termine.
Al fine dunque di identificare terapie più efficaci e mirate, in questi decenni si è cercato di caratterizzare in modo più approfondito tale tumore andando a valutarne prima di tutto le alterazioni geniche. Una di queste è la sovraespressione del proto-oncogene MYCN, la cui amplificazione (presente in circa il 20-30% dei neuroblastomi) è prevalentemente associata ad una progressione rapida del tumore e ad esito sfavorevole (Brodeur, 2003).
Il tasso di sopravvivenza per i casi di neuroblastoma con MYCN amplificato è, infatti, solo il 15% nonostante i progressi ottenuti negli ultimi anni nel trattamento dei tumori pediatrici (Katzenstein et al. 1998). MYCN appartiene a una famiglia di geni che include altri due oncogeni, C-MYC e L-MYC, e che con questi condivide un dominio di legame al DNA del tipo bHLHZip in grado di formare dimeri con le proteine della famiglia Max (Grandori et al., 2000).
L'espressione di MYCN è ristretta agli stadi precoci di sviluppo embrionale suggerendo che esso svolga un ruolo essenziale nei processi proliferativi.
Le alterazioni di MYCN si verificano in un ampia gamma di tumori e vanno dall'amplificazione del gene, alla sua traslocazione su altri cromosomi e a mutazioni nel suo promotore. Tutte comportano un'alterazione dell'espressione del gene (Westermann and Schwab, 2002).
MYCN rappresenta un elemento chiave nell'insorgenza e nella progressione del neuroblastoma, pertanto da un lato si tenta di trovare nuove molecole in grado di bloccarne la funzione, dall’altro si cerca di identificare geni direttamente regolati da MYCN che svolgano un ruolo critico nella biologiawdelwtumore.
Dati preliminari del Dott. Sala dell’ “Institute of Child Health” di Londra suggeriscono che il fattore di trascrizione BMYB possa agire a valle di MYCN. BMYB, appartenente alla famiglia dei geni myb, è infatti coinvolto nella proliferazione cellulare e nella regolazione del ciclo cellulare (Joaquin, Watson, 2003).
Il mio progetto di ricerca consiste quindi nel caratterizzare in maniera più approfondita l’asse MYCN-BMYB.
Per prima cosa ho selezionato, mediante western-blotting, linee cellulari di neuroblastoma in cui MYCN è amplificato (LAN5, LAN1, Kelly, HTLA e IMR32) e linee in cui non lo è (SHEP, SH-SY-5Y, SK-N-AS, GIMEN, ACN).     
Successivamente, per valutare il legame di MYCN al promotore di BMYB, ho condotto un saggio di “Chromatin Immunoprecipitation” su tutte queste linee cellulari di neuroblastoma, dal quale si è potuto osservare che MYCN si lega, con alta efficienza, direttamente al promotore di BMYB solo nelle linee cellulari di neuroblastoma in cui MYCN è amplificato.
Per determinare, quindi, se le linee cellulari di neuroblastoma MYCN amplificate dipendano da BMYB, ho condotto un saggio di proliferazione cellulare su quattro linee cellulari, due con MYCN amplificato (LAN-1 e GI-LIN) e due con MYCN non amplificato (GIMEN e ACN): ho infettato queste cellule mediante vettori lentivirali codificanti un shRNA per BMYB o un shRNA scrambled.
Dopo due settimane di selezione con puromicina, ho piastrato a bassa densità le cellule sopravvissute, e dopo 14 giorni ho contato le cellule infettate con i lentivirus recanti il shRNA per B-MYB o il shRNA scrambled: il knock-down di B-MYB provoca una forte riduzione (75-80%) della proliferazione delle LAN-1 e delle GILIN, MYCN amplificate, ma non delle GI-MEN e delle ACN, MYCN non amplificate.
Questo risultato dimostra che BMYB è fondamentale per la sopravvivenza delle linee cellulari di neuroblastoma con MYCN amplificato.
Attualmente sto valutando il ciclo cellulare, mediante marcatura con propidio ioduro e analisi citometrica a flusso, delle linee cellulari di neuroblastoma MYCN amplificate, infettate stabilmente con il shRNA per BMYB.
Parallelamente alla caratterizzazione dell’asse MYCN-BMYB, il progetto procederà con lo screening di una serie di composti potenzialmente inibitori di BMYB.

Referenze:

Brodeur GM. Neuroblastoma: biological insights into a clinical enigma. Nat Rev Cancer
2003;3(3):203-16

Brossard J, Bernstein ML, Lemieux B. Neuroblastoma: an enigmatic disease. Br Med Bull 1996;
52(4):787-801
Grandori C, Cowley SM, James LP, Eisenman RN. The Myc/Max/Mad network and the transcriptional control of cell behavior. Annu Rev Cell Dev Biol 2000;16:653-99
Joaquin M, Watson RJ. Cell cycle regulation by the B-Myb transcription factor. Cell Mol Life Sci
2003;60(11):2389-401

Katzenstein HM, Bowman LC, Brodeur GM, Thorner PS, Joshi VV, Smith EI, Look AT, Rowe ST, Nash MB, Holbrook T, Alvarado C, Rao PV, Castleberry RP, Cohn SL. Prognostic significance of age, MYCN oncogene amplification, tumor cell ploidy, and histology in 110 infants with stage D(S) neuroblastoma: the pediatric oncology group experience--a pediatric oncology group study. J Clin Oncol 1998 Jun;16(6):2007-17

Westermann F, Schwab M. Genetic parameters of neuroblastomas. Cancer Lett 2002 Oct 28;184(2):127-47. Review.