SOCIETA' ITALIANA DI FARMACOLOGIA
Relazioni dei borsisti sif
RELAZIONE
ATTIVITA’ SCIENTIFICA all'ESTERO
Dott.ssa Ilaria Gnemmi
Dipartimento DISCAFF, Facoltà di Farmacia, Novara
Università del Piemonte Orientale “A. Avogadro”
RELAZIONE DELL’ATTIVITA’ DI RICERCA ALL’ESTERO
SVOLTA PRESSO L’”INSTITUTE OF CHILD HEALTH” DI LONDRA (UK)
NEL LABORATORIO DEL DOTT. ARTURO SALA
“Il neuroblastoma è il più comune tumore solido di natura extracranica dell’infanzia, costituendo circa il 10% dei tumori pediatrici e l’80% di quelli dei bambini al di sotto dei 5 anni (Brossard et al., 1996).
E’ caratterizzato dalla trasformazione cancerogena di neuroblasti simpatici immaturi, derivanti dalla cresta neurale, che hanno perso la loro capacità di differenziarsi in cellule mature (Brodeur, 2003).
La localizzazione più comune del neuroblastoma è l’addome, ma possono essere colpiti anche il torace, il collo e il bacino.
Il neuroblastoma può presentarsi in vari stadi:
- STADIO I: il tumore è confinato nell’organo o struttura di origine.
- STADIO II: il tumore è esteso oltre l’organo o struttura di origine senza però oltrepassare la linea mediana.
- STADIO III: il tumore è esteso oltre la linea mediana.
- STADIO IV: il tumore è metastatico (coinvolgimento di scheletro, organi, tessuti molli e gruppi di linfonodi distanti dalla sede di origine del tumore).
- STADIO IV-S: è rappresentato da pazienti che possono rientrare nello stadio I e II ma hanno disturbi confinati in uno o più organi quali pelle, fegato e midollo osseo (senza evidenze radiografiche di metastasi alle ossa) (Carlsen et al., 1986). Il neuroblastoma in fase IV-S può regredire spontaneamente.
La progressione biologica del neuroblastoma è, infatti, imprevedibile: il tumore può regredire spontaneamente, maturare a ganglioneuroma, o progredire rapidamente verso fenotipi più aggressivi (Westermann and Schwab, 2002).
Clinicamente, la prognosi del neuroblastoma è fortemente correlata allo stadio del tumore e all’età in cui viene diagnosticato.
La chemioterapia multipla (cisplatino, doxorubicina, ciclofosfamide e teniposide) rappresenta l’approccio più convenzionale alla malattia, specialmente negli stadi più avanzati. Sfortunatamente, il neuroblastoma sviluppa frequentemente resistenza alla chemioterapia, dando esiti clinici sfavorevoli.
Un elevato numero di alterazioni genetiche è stato identificato nelle cellule di neuroblastoma; l’amplificazione del protooncogene MYCN, localizzato nella porzione distale del braccio corto del cromosoma 2 (2p24), costituisce una delle aberrazioni genetiche più spesso associate a cattiva prognosi, e avviene in circa il 20%-25% dei neuroblastomi umani (Brodeur, 2003).
La sovraespressione esogena di MYCN nel neuroectoderma di topi transgenici (NMyc-Tg) provoca neuroblastomi con caratteristiche simili a quelle osservate nella patologia umana (Weiss et al., 1997); di contro, l’inibizione di MYCN mediante tecniche antisenso provoca la regressione del tumore sia in vivo sia in vitro (Lu et al., 2003; Burkhart et al., 2003).
Il ruolo di MYCN è ben noto nella tumorigenesi, in particolar modo quella del neuroblastoma, tuttavia non sono ancora del tutto noti i geni la cui attivazione è necessaria ad esprimere il suo potenziale trasformante.
Il mio progetto di ricerca nel laboratorio del Dott. Arturo Sala presso l’Institute of Child Health di Londra è consistito nel caratterizzare nel neuroblastoma l’asse tra MYCN e il fattore di trascrizione BMYB e, successivamente, di screenare una serie di composti potenzialmente inibitori di BMYB.
Dati preliminari del Dott. Sala suggerivano, infatti, che BMYB, appartenente alla famiglia dei geni myb e coinvolto nella proliferazione cellulare e nella regolazione del ciclo cellulare (Joaquin and Watson, 2003), potesse agire a valle di MYCN ed essere richiesto per la sua attività trasformante.
Per prima cosa ho selezionato le linee cellulari di neuroblastoma, disponibili nel laboratorio, in cui MYCN è amplificato (LAN5, LAN1, Kelly, HTLA e IMR32) e in cui non lo è (SHEP, SH-SY-5Y, SK-N-AS, GIMEN, ACN) e, mediante western-blot, ho valutato in queste l’espressione di BMYB, osservando una sua sovra-espressione solo nelle linee cellulari MYCN-amplificate.
Esperimenti successivi hanno dimostrato l’importanza di BMYB per la sopravvivenza delle linee cellulari di neuroblastoma MYCN-amplificate. Conducendo un saggio di proliferazione cellulare su quattro linee di neuroblastoma, due con MYCN amplificato (LAN-1 e GI-LIN) e due con MYCN non amplificato (GIMEN e ACN), infettate mediante vettori lentivirali codificanti un shRNA per BMYB o un shRNA scrambled, ho potuto infatti osservare che il knock-down di BMYB riduceva drasticamente (75-80%) la proliferazione delle LAN-1 e delle GILIN, ma non quella delle GI-MEN e delle ACN, confermando così la dipendenza delle linee cellulari di neuroblastoma MYCN amplificate dal fattore di trascrizione BMYB.
In seguito ho condotto dei saggi di “Chromatin Immunoprecipitation” su tutte le linee di neuroblastoma per valutare il legame tra MYCN e BMYB, scoprendo che soltanto nelle linee cellulari di neuroblastoma in cui MYCN è amplificato, MYCN si lega con alta efficienza direttamente al promotore di BMYB, attivando una sua deregolata espressione. Inoltre, BMYB è in grado di legarsi all’amplicone di MYCN. Pertanto, nonostante la sua debole attività trascrizionale intrinseca, BMYB induce un aumento significativo dell’espressione di MYCN, a causa del grande numero di ampliconi disponibili.
Nelle linee di neuroblastoma MYCN-amplificate, si instaura quindi un loop regolatorio reciproco tra MYCN e il fattore di trascrizione BMYB. Questo loop rappresenta un interessante bersaglio farmacologico per i neuroblastomi in cui MYCN è amplificato, che sono quelli più aggressivi.
Quindi, una volta caratterizzato l’asse MYCN-BMYB, ho condotto uno screening di circa 1500 composti, per lo più di origine sintetica, potenzialmente inibitori di BMYB.
Dopo aver clonato una sequenza recante due siti di legame per BMYB all’interno di un vettore contenente il gene reporter per luciferasi, ho trasfettato stabilmente le GI-MEN (cellule di neuroblastoma MYCN non amplificate) con questo costrutto e con un vettore contenente BMYB (pCMV-BMYB). Ho trattato poi queste cellule con i composti sopra indicati e ho confrontato l’attività luciferasica (valutata mediante il Saggio della Luciferasi) delle cellule trattate rispetto a quella delle cellule non trattate (controllo). In maniera interessante, alcuni composti riducevano notevolmente l’attività luciferasica. Esperimenti successivi hanno permesso di selezionare all’interno di questo gruppo di composti, circa una decina di sostanze che non inibivano la trascrizione basale ma, in modo specifico, BMYB.
Questi composti, la cui completa caratterizzazione necessita ora numerosi studi funzionali, appaiono particolarmente interessanti, in quanto, dato il loop individuato tra MYCN e BMYB, aprono la strada ad un nuovo approccio terapeutico per i neuroblastomi con MYCN amplificato, ossia quelli più aggressivi e resistenti alla chemioterapia classica.
Referenze:
- Brodeur GM. Neuroblastoma: biological insights into a clinical enigma. Nat Rev Cancer 2003;3(3):203-16.
- Brossard J, Bernstein ML, Lemieux B. Neuroblastoma: an enigmatic disease. Br Med Bull 1996; 52(4):787-801.
- Burkhart CA, Cheng AJ, Madafiglio J, Kavallaris M, Mili M, Marshall GM, Weiss WA, Khachigian LM, Norris MD, Haber M. Effects of MYCN antisense oligonucleotide administration on tumorigenesis in a murine model of neuroblastoma. J Natl Cancer Inst 2003;95(18):1394-403.
- Carlsen NL, Christensen IJ, Schroeder H, Bro PV, Hesselbjerg U, Jensen KB, Nielsen OH. Prognostic value of different staging systems in neuroblastomas and completeness of tumour excision. Arch Dis Child 1986; 61(9): 832-842.
- Joaquin M, Watson RJ. Cell cycle regulation by the B-Myb transcription factor. Cell Mol Life Sci 2003;60(11):2389-401.
- Lu X, Pearson A, Lunec J. The MYCN oncoprotein as a drug development target. Cancer Lett 2003;197(1-2):125-30.
- Weiss WA, Aldape K, Mohapatra G, Feuerstein BG, Bishop JM. Targeted expression of MYCN causes neuroblastoma in transgenic mice. Embo J 1997;16(11):2985-95.
- Westermann F, Schwab M. Genetic parameters of neuroblastomas. Cancer Lett 2002 Oct 28;184(2):127-47.