SOCIETA' ITALIANA DI FARMACOLOGIA
Relazioni dei borsisti sif
RELAZIONE
ATTIVITA’ SCIENTIFICA
GIUGNO 2007 – SETTEMBRE 2007
Dott. Gianluca Grassia
Dipartimento di Farmacologia Sperimentale
Università degli Studi di Napoli, Federico II
La restenosi rappresenta ancora la maggiore limitazione nell’interventistica coronarica percutanea, con un’incidenza di circa il 30-50% nei primi 6 mesi dall’intervento. Diverse evidenze sperimentali, sia nell’uomo che nell’animale, suggeriscono che l’infiammazione svolge un ruolo centrale in questo fenomeno 1,2. Il fenomeno della restenosi che si osserva dopo impianto di stent è dovuto soprattutto alla migrazione e alla proliferazione delle cellule muscolari lisce vasali (VSMC) con formazione neointimale, mentre un fenomeno di rimodellamento vascolare “vascular remodelling” accompagnato dalla migrazione e la proliferazione delle VSMC contribuisce alla restenosi in seguito ad angioplastica 3. Pertanto chiarire i meccanismi fisiopatologici alla base della restenosi ha una notevole rilevanza clinica 2,4 ed è utile allo sviluppo di farmaci e presidi in grado di ridurre il rischio sia di formazione di neointima in seguito ad angioplastica che lo sviluppo di trombosi in seguito da stenting.
E’ noto che il fattore di trascrizione nucleare “Nuclear Factor-κB” (NF-κB) regola i processi infiammatori e gioca un ruolo cruciale nella risposta vascolare al danno 5. NF-κB è attivato nelle lesioni aterosclerotiche e restenotiche umane ed è localizzato nelle VSMC, nei macrofagi e nelle cellule endoteliali 5. Nell’uomo l’attivazione di NF-κB si osserva nella parete di vasi sottoposti ad angioplastica 6.
NF-κB è attivato anche in un modello di lesione meccanica della carotide di ratto e tale attivazione è associata sia alla formazione di neointima che all’espressione di geni che codificano per molecole di adesione, citochine e fattori di crescita 7. Inoltre, recentemente è stato dimostrato che il rilascio locale di NF-κB decoy, attraverso l’applicazione di uno stent nell’arteria iliaca di conigli ipercolesterolemici, riduce significativamente il fenomeno infiammatorio e le dimensioni della lesione intimale 5.
L’attivazione di NF-κB avviene ad opera del complesso della chinasi di IκB (IKK) che fosforilando la subunità IκB ne permette il distacco dal complesso NF-κB che libero può migrare nel nucleo attivando la trascrizione 8. Entrambe le subunità catalitiche di IKK, IKKα e IKKβ, interagiscono con una regione amino terminale ad α-elica della subunità regolatrice NEMO (NF-κB essential modulator) attraverso una sequenza esapeptidica carbossi-terminale denominata “NEMO binding domain” (NBD) 9. E’ stato sintetizzato un peptide contenente la sequenza NBD (da cui il nome NBD) di IKKβ, allo scopo di impedire il legame della subunità catalitica β a NEMO, distruggendo così l’integrità strutturale e funzionale del complesso IKK 9. E’ stato dimostrato in un modello di artrite nel topo che il trattamento con NBD, è efficace nell’inibire il decorso della malattia infiammatoria 10.
E’ interessante sottolineare che il peptide NBD blocca solo l’attivazione di NF-κB in risposta a stimoli pro-infiammatori e non ne influenza l’attività basale 11.
L’effetto del peptide NBD, nell’inibire le risposte immuno-infiammatorie nelle patologie vascolari, non è stato ancora indagato. A tal fine, il progetto di ricerca che mi vede impegnato si propone di studiare l’effetto di NBD nella formazione di neointima utilizzando un modello sperimentale di danno vascolare nel ratto (balloon angioplasty) 7.
La lesione meccanica dell’intima dell’arteria carotide comune sinistra è eseguita mediante un catetere munito di palloncino (2F, Fogarty) gonfiato a 2 atm introdotto attraverso la carotide esterna. In esperimenti preliminari il peptide NBD (300 μg/sito) è stato somministrato mediante applicazione locale sul vaso danneggiato, usando una soluzione di gel pluronico F127 12. In alcuni esperimenti era utilizzato un peptide con una sequenza mutata (mut-NBD; 300 μg/sito) 10. Gli animali di controllo ricevevano il solo gel pluronico. Dopo 14 giorni dall’induzione del danno le carotidi sono state rimosse, fissate in una soluzione di formalina al 10% e dalla porzione centrale dell’arteria, erano ricavate 10 sezioni trasversali di 6 μm ciascuna. Le sezioni, colorate con ematossilina ed eosina, erano fotografate e si procedeva, quindi, alla valutazione dell’area della media e della neointima, nonché alla valutazione della circonferenza della lamina elastica interna e della lamina elastica esterna del vaso. L’analisi morfologica evidenziava che il trattamento con il peptide NBD alla dose di 300 μg/sito riduceva significativamente la formazione di neointima del 30% (n = 10; P<0.05) rispetto al gruppo di controllo mentre il peptide mutato non aveva alcun effetto.
Allo scopo di chiarire il meccanismo alla base dell’inibizione della formazione neointimale gli studi proseguiranno con indagini di biologia molecolare condotte su carotidi danneggiate per valutare il grado di attivazione di NF-κB nonchè l’espressione di geni da esso controllati. Inoltre, si valuterà l’effetto del peptide NBD sulla proliferazione, migrazione ed invasione delle cellule muscolari lisce vasali in vitro.
1
Schwartz RS and Henry TD. Rev Cardiovasc Med. 2002; 3: S4-S9.
2
Welt FG and Rogers C. Arterioscler Thromb Vasc Biol.2002;
22:1769-76.
3
Indolfi C et al. Cardiol Rev. 1999; 7:324-331.
4
Farb A and Boam AB. N. Engl. J. Med. 2007; 356: 984-987.
5
Ohtani K et al. Circulation. 2006; 114: 2773-2779.
6
Jun-Ichi S et al. Circ J. 2004; 68: 270-1.
7
Maffia P et al. Circulation. 2006; 114: 430-7
8
Hayden MS and Ghosh S. Genes & Development. 2004; 18:
2195-2224.
9
May MJ et al. Science. 2000; 289:1550-1554.
10
Jimi E et al. Nat Med. 2004; 10: 617-624.
11
Kucharczak J et al. Oncogene. 2003; 22: 8961-8982.
12
Ianaro A et al. FEBS Lett. 2003; 553: 21-7.
Dott.
Gianluca Grassia
Dipartimento di Farmacologia Sperimentale
Università degli Studi di Napoli, Federico II