SOCIETA' ITALIANA DI FARMACOLOGIA
Relazioni dei borsisti sif
RELAZIONE
ATTIVITA’ SCIENTIFICA
Ottobre – Dicembre 2007
Dott. Gianluca Grassia
Dipartimento di Farmacologia Sperimentale
Università degli Studi di Napoli, Federico II
La
restenosi rappresenta ancora la maggiore limitazione nell’interventistica
coronarica percutanea, con un’incidenza di circa il
30-50% nei primi 6 mesi dall’intervento (1). Un ruolo
centrale nella genesi di tale patologia è svolto dalle
cellule muscolari lisce vasali (VSMC) che, in seguito al danno
vascolare, vanno incontro a proliferazione e migrazione dalla
media dei vasi nell’intima, con formazione di una nuova
struttura chiamata “neointima”, nonché
all’acquisizione di un fenotipo secernente di tipo pro-infiammatorio
e resistenza a stimoli apoptotici (2,3). Di conseguenza, l’individuazione
di strategie farmacologiche dirette a ridurre l’incidenza
della restenosi non può prescindere dallo studio delle
VSMC. Gli studi clinici dimostrano, infatti, che le uniche
terapie che a tutt’oggi risultano efficaci (es. Sirolimus)
agiscono riducendo la capacità proliferativa delle
VSMC (4-6).
E’ noto che il fattore di trascrizione nucleare “Nuclear
Factor-κB” (NF-κB) è
attivato nelle lesioni aterosclerotiche e restenotiche umane
ed è localizzato nelle VSMC, nei macrofagi e nelle
cellule endoteliali (7). Nell’uomo l’attivazione
di NF-κB si osserva nella parete di vasi sottoposti
ad angioplastica (8). Inoltre, l’attivazione di NF-κB
è responsabile, almeno in parte, dei fenomeni di proliferazione
e migrazione delle VSMC (3).
L’attivazione di NF-κB avviene ad opera
del complesso della chinasi di IκB (IKK) che fosforilando
la subunità IκB ne permette il distacco
dal complesso NF-κB che libero può migrare
nel nucleo attivando la trascrizione di un’ampia varietà
di geni codificanti per molecole mediatrici dell’infiammazione
(9), tra cui la chemochina MCP-1 (Monocyte Chemoattractant
Protein-1), il cui ruolo nel danno vascolare è ben
documentato (10). Entrambe le subunità catalitiche
di IKK, IKKa e IKKß, interagiscono con una regione amino
terminale ad a-elica della subunità regolatrice NEMO
(NF-κB essential modulator) attraverso una sequenza
esapeptidica carbossi-terminale denominata “NEMO binding
domain” (NBD) (11). E’ stato decritto che il peptide
NBD, contenente la sequenza NBD di IKKß, impedisce il
legame della subunità catalitica ß a NEMO, distruggendo
così l’integrità strutturale e funzionale
del complesso IKK (12). Il peptide NBD è in grado,
sia in vitro che in vivo, di ridurre le risposte infiammatorie
(13,14).
Il progetto di ricerca che mi vede impegnato si propone di
studiare l’effetto del peptide NBD nella formazione
di neointima sia in vivo che in vitro. In precedenza abbiamo
osservato in un modello sperimentale di lesione meccanica
dell’intima della carotide comune di ratto (balloon
angioplasty) una riduzione significativa della formazione
di neointima negli animali trattati con NBD (300 µg/sito).
Lo studio è proseguito in vitro valutando l’effetto
del peptide NBD sulla proliferazione delle VSMC, nonché
sul grado di attivazione di NF-κB ed espressione
in tali cellule di MCP-1.
Le VSMC erano isolate utilizzando la metodica dell’espianto.
In breve, segmenti di aorta toracica erano prelevati da ratti
Wistar del peso di 200-250g, l’avventizia era accuratamente
rimossa e l’endotelio era allontanato mediante l’utilizzo
di uno scraper. Gli espianti tessutali erano incubati in Dulbecco’s
modified Eagle’s medium (DMEM) addizionato del 20% di
fetal bovine serum (FBS). Dopo 10 giorni le cellule migrate
dall’espianto erano rimosse per tripsinizzazione e seminate
in fiasche con DMEM addizionato del 10% di FBS. Tutti gli
esperimenti erano condotti con cellule fra il terzo e il sesto
passaggio.
La proliferazione delle VSMC era indotta mediante TNF-a (5
ng/ml) e valutata dopo 48h mediante la metodica dell’MTT.
I risultati dimostravano che il peptide NBD (1-100 μM)
era in grado di ridurre in maniera significativa, di circa
il 30%, la proliferazione delle VSMC alla concentrazione più
alta utilizzata.
Allo scopo di valutare se la riduzione della proliferazione
dipendeva dall’inibizione dell’attivazione di
NF-κB sono stati condotti esperimenti di EMSA
(Electrophoretic Mobility Shift Assay) su estratti nucleari
di VSMC stimolate con TNF-a (5 ng/ml) in presenza o assenza
di NBD (100 µM). La stimolazione con TNF-a determinava
un incremento dell’attività di legame di NF-κB
al DNA che risultava significativamente ridotta (circa il
50%) dal trattamento con il peptide (100 µM).
Infine, la stimolazione delle VSMC con TNF-a (5 ng/ml) causava
un incremento della produzione di MCP-1, valutato mediante
ELISA, che risultava significativamente ridotta del 30% dal
trattamento con il peptide NBD (100 µM).
In conclusione, i risultati dimostrano che il peptide era
in grado di inibire la proliferazione delle VSMC indotta da
TNF-a. Tale inibizione era associata ad una riduzione del
grado di attivazione di NF-κB nonché della
espressione in tali cellule di MCP-1, una chemochina il cui
gene è regolato da NF-κB ed il cui ruolo
nel danno vascolare è ampiamente noto.
Nel proseguo degli studi, proseguiranno valutando l’effetto
del peptide NBD su migrazione ed invasione delle VSMC, due
fenomeni, che insieme alla proliferazione, concorrono alla
formazione neointimale.
1 Schwartz RS and Henry TD. Rev Cardiovasc
Med. 2002; 3: S4-S9
2 Berk BC. Physiol Rev. 2001; 8: 999-1030.
3 Patel VI et al. FASEB J. 2006; 20: 1418-1430
4 Douglas JS. Am J Cardiol. 2007; 100: 10K-16K
5 King SB 3rd. Am J Cardiol. 2007; 100: 25K-31K
6 Morice MC et al. N. Engl. J. Med. 2002; 346,1773-1780
7 Ohtani K et al. Circulation. 2006; 114: 2773-2779.
8 Jun-Ichi S et al. Circ J. 2004; 68: 270-1.
9 Maffia P et al. Circulation. 2006; 114: 430-7
10 Egashira K et al. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2007;
27: 2563-8.
11 Hayden MS and Ghosh S. Genes & Development. 2004; 18:
2195-2224.
12 May MJ et al. Science. 2000; 289:1550-1554.
13 Jimi E et al. Nat Med. 2004; 10: 617-624.
14 Kucharczak J et al. Oncogene. 2003; 22: 8961-8982.
Dott. Gianluca Grassia
Dipartimento di Farmacologia Sperimentale
Università degli Studi di Napoli, Federico II