SOCIETA' ITALIANA DI FARMACOLOGIA
Relazioni dei borsisti sif
RELAZIONE ATTIVITA’ SCIENTIFICA all'ESTERO
Dott.ssa Alma Martelli
Università degli Studi di Pisa
Relazione finale attività scientifica all’estero
Biomedical Research Centre Sheffield-Hallam University
Il solfuro d’idrogeno (H2S), una molecola gassosa che fin’ora era nota solo come agente tossico, sta emergendo quale modulatore endogeno che condivide con l’ossido d’azoto (NO) quasi tutti i suoi effetti benefici sul sistema cardiovascolare, senza però costituire una fonte di metaboliti tossici. Al contrario, H2S mostra un profilo di antiossidante tipico dei solfuri organici ed inorganici, rivestendo così, realmente un ruolo di scavenger delle specie reattive dell’ossigeno. H2S viene sintetizzato in quantità apprezzabili, in molti tessuti dei mammiferi, grazie all’azione degli enzimi cistationina beta-sintasi (CBS) e cistationina gamma-liasi (CSE). In particolare CSE rappresenta la principale fonte di H2S nel sistema cardiovascolare.
Attualmente non disponiamo di una conoscenza esauriente di tutti i ruoli biologici esercitati da questo gas. Oltre ai meccanismi non specifici sopra descritti, ci sono però evidenze inconfutabili circa l’attivazione dei canali del potassio ATP-sensibili (KATP) quale target molecolare utilizzato da H2S per indurre il rilasciamento della muscolatura liscia vascolare. Questo meccanismo specifico sta alla base anche degli effetti cardioprotettivi esercitati da H2S contro il danno miocardico da ischemia/riperfusione. Sono stati ipotizzati altri meccanismi rilevanti, sia endotelio-dipendenti che endotelio-indipendenti ma la loro natura è ancora poco chiara. Infatti, H2S è in grado di inibire la proliferazione della muscolatura liscia vascolare e di contrastare l’aggregazione piastrinica sebbene attraverso meccanismi d’azione ancora da definire.
Per quanto riguarda l’implicazione fisiopatologica del “Sistema dell’H2S” endogeno, evidenze sperimentali suggeriscono che la sua alterazione contribuisca pesantemente alla patogenesi dell’ipertensione; analogamente, una diminuzione della biosintesi di H2S contribuisce all’instaurarsi di complicanze cardiovascolari osservate in modelli sperimentali di diabete mellito.
Da tali premesse emerge l’importanza di una modulazione farmacologica di questo sistema, attraverso lo sviluppo di nuovi agenti terapeutici, ed in particolare di molecole in grado si rilasciare H2S esogeno e dunque sopperire alla sua carenza endogena, osservata in diversi stati patologici.
Inoltre l’evidente interazione fra H2S e le funzioni endoteliali suggerisce l’esistenza di un cross-talk fra H2S e NO. In particolare, dati recenti indicano una possibile correlazione fra l’alterazione del sistema dell’H2S e il progredire della condizione di disfunzione endoteliale. Le proprietà biologiche di H2S sono dunque un importante crocevia tra le caratteristiche di NO e il ruolo fisio-farmacologico dei canali del potassio; argomenti che rappresentano i temi fondamentali del lavoro di indagine scientifica da me condotta durante questi anni (Martelli et al., 2011).
Studi recenti da me condotti su anelli di aorta di ratto e cellule di muscolatura liscia di aorta umana sembrano tuttavia mettere in luce il possibile coinvolgimento di altri tipi di canali del potassio, oltre al KATP, nell’azione iperpolarizzante esercitata da donatori di H2S, in particolare mediante l’uso di bloccanti è stato possibile isolare una componente dell’azione vasorilasciante o iperpolarizzante riconducibile all’azione dei canali del potassio voltaggio operati (Kv). Durante questa prima parte del periodo di soggiorno all’estero mi sono dedicata all’apprendimento e alla messa a punto, su cellule HASMC (Human Aortic Smooth Muscle Cells), di una metodica altamente specifica già impiegata per lo studio di diversi tipi di canali del potassio, la tecnica dell’efflusso di Rubidio. La misurazione dell’efflusso di Rubidio rappresenta infatti uno strumento di indagine consolidato e riproducibile per la valutazione dell’attività dei canali del potassio. Infatti lo ione Rb+, che è una specie fisiologicamente non presente negli organismi animali, è considerato un “potassio-mimetico”, in quanto i canali al potassio (ed anche i vari trasportatori e scambiatori trans-membranali) presentano pressoché la medesima selettività per gli ioni K+ e Rb+. Pertanto i flussi trans-membranali di Rb+ esogeno sfruttano esclusivamente le medesime vie utilizzate fisiologicamente dal K+, come ad esempio i canali ionici K+-selettivi. La misurazione di tali flussi di Rb+ rappresenta dunque un indice selettivo e preciso dell’attività di tali canali. Tale principio è stato in passato ampiamente sfruttato mediante l’utilizzo di approcci radiometrici che prevedono l’impiego dell‘isotopo radioattivo 86Rb+ come tracciante dei flussi dello ione potassio.
Al contrario, la metodica messa a punto nel laboratorio di “Farmacologia dei canali ionici” del Biomedical Research Centre (Department of Biosciences, Sheffield Hallam University, UK), presso il quale sto svolgendo il soggiorno di studio all’estero, rappresenta un approccio più moderno e più versatile per studi farmacologici, poichè si basa sulla misurazione spettrometrica di assorbimento atomico del Rb+ e dunque non prevede l’utilizzo dei suoi isotopi radioattivi. In particolare, il protocollo sperimentale da me condotto in questa prima parte di soggiorno all’estero, prevede l’impiego della suddetta tecnica secondo due diversi approcci: uno “diretto” e l’altro “inverso”.
La prima metodica prevede che le colture cellulari di HASMC siano incubate in opportune soluzioni di Rb+, consentendo dunque che questo ione si concentri nel citosol, e siano quindi esposte ai trattamenti farmacologici in un secondo momento, finalizzati a influenzare il flusso out-ward dello ione. La seconda metodica prevede invece che gli apritori dei canali del potassio siano incubati nelle cellule contestualmente al buffer contenente Rb+, in questo caso, ciò che viene osservato è la capacità di tali molecole di indurre un maggior influsso di Rb+ all’interno delle HASMC. In entrambe le metodiche, al fine di individuare ed eventualmente escludere meccanismi di transito trans-membranario per il Rb+, alternativi ai canali del K+, gli esperimenti sono stati condotti anche in presenza di Ouabaina, quale bloccante della Na+/K+-ATP-asi. L’atomizzazione e la vaporizzazione su fiamma dei campioni (costituiti dai sovranatanti e dai lisati cellulari nel primo caso e dai soli lisati nel secondo), e la misurazione spettrometrica di assorbimento atomico alla lunghezza d’onda di 780.1 nm (specifica per l’atomo di Rb+) consentono quindi la valutazione qualitativa e quantitativa della concentrazione dell’elemento. La registrazione delle variazioni di concentrazione di Rb+ nei campioni è correlabile alle eventuali correnti di Rb+ attraverso canali al potassio e alla modulazione di tali canali ionici da parte dei trattamenti farmacologici.
Gli esperimenti condotti hanno consentito di evidenziare alcune caratteristiche delle HASMC in relazione ai meccanismi di accumulo ed estrusione dello ione Rb+; in particolare:
- Le HASMC pre-incubate con lo ione, mettono in atto efficaci e relativamente rapidi meccanismi di efflusso del Rb+, probabilmente legato a correnti mediate da canali del K+, attivi anche a livelli di “resting membrane potential”.
- L’utilizzo di attivatori farmacologici di canali del K+ (importanti a livello vascolare), quali i canali KATP e BK, non porta ad ulteriori variazioni della velocità e della cinetica dell’efflusso di Rb+;
- L’incubazione di HASMC in Rb+ è seguita da un rapido e quantitativamente rilevante accumulo dello ione nelle cellule;
- Tale accumulo è significativamente ridotto (ma non abolito) dall’Ouabaina, ed è quindi mediato in parte dalla Na+/K+-ATPasi;
- L’utilizzo contemporaneo di Ouabaina e bloccanti non selettivi di canali del K+ porta ad una marcata e quasi completa abolizione della captazione di Rb+, indicando il ruolo di canali del K attivi anche a livelli di “resting membrane potential”;
- Anche l’utilizzo contemporaneo di Ouabaina e Linopirdina, bloccante selettivo dei canali del K del tipo Kv7 porta ad una marcata e quasi completa abolizione della captazione di Rb+, indicando il ruolo di tale canale voltaggio-operato del K+ nel meccanismo di up-take di Rb+.
Nella seconda fase del mio soggiorno all’estero, l’attività sperimentale si è concentrata sull’applicazione della metodica dell’efflusso di Rb+ ad un substrato biologico diverso seppur analogo a quello cellulare delle HASMC, ovvero, la tecnica precedentemente descritta come “prima metodica” è stata applicata ad anelli di aorta toracica di ratto. A tal fine sono stati impiegati ratti albini di ceppo Wistar e di sesso maschile ai quali, previa anestesia, è stata espiantata la porzione toracica dell’aorta, la quale è stata accuratamente toelettata al fine di rimuovere qualunque tessuto estraneo a quello muscolare liscio, quale il tessuto connettivo. Inoltre la necessità di studiare l’azione esclusivamente sulla muscolatura ha reso necessaria la rimozione dell’endotelio mediante leggera abrasione meccanica. L’aorta così ripulita è stata sezionata in 12 anellini di 2 mm l’uno, i quali sono stati immersi in un’opportuna soluzione contenete Rb+ per un tempo d’incubazione di 4 ore in modo tale che le cellule muscolari potessero accumulare tale ione. Al termine dell’incubazione sono stati effettuati lavaggi con buffer privo di Rb+ al fine di rimuovere tutto il Rb+ in eccesso non incamerato dalle cellule, quindi gli anelli di aorta sono stati esposti per 20 min ai vari trattamenti con NaHS (1mM) in presenza o in assenza di diversi bloccanti al fine di evidenziarne il meccanismo d’azione. Al termine dei trattamenti il mezzo nel quale è stato immerso ciascun anellino è stato prelevato e predisposto per l’analisi del Rb+ fuoriuscito dalle cellule dopo l’esposizione ai trattamenti. Ciascun anellino è stato quindi pesato al fine di poter effettuare una normalizzazione del dato finale in base al peso quale riferimento al numero di cellule presenti nella porzione di tessuto. Quindi gli stessi anellini sono stati sottoposti al trattamento con Triton-X 100 per 20 ore al fine di provocare la completa lisi cellulare ed assicurare il rilascio nel mezzo, di tutto il Rb+ contenuto all’interno delle cellule. Le quantità di Rb+ contenute nel mezzo pre-lisi e nel lisato sono state quindi determinate ed espresse in percentuale. Dai dati ottenuti, emerge che negli anelli trattati con NaHS è stato registrato un significativo incremento di circa un 20% nell’efflusso di Rb+, rispetto a quanto registrato nei preparati vascolari trattati con il veicolo; l’osservazione di tale incremento costituisce un’ulteriore dimostrazione dell’attivazione di canali al potassio da parte di H2S. L’effetto indotto da NaHS non subisce alcun antagonismo da parte della 4-amminopiridina (3mM), un bloccante di diversi tipi di canali del potassio fra i quali numerosi Kv (ma non i Kv7), mentre viene parzialmente ridotto dalla Glibenclamide (10±M, bloccante dei canali KATP) a testimonianza di un parziale contributo da parte dei canali KATP. Infine l’incremento di efflusso di Rb+ indotto da NaHS è risultato marcatamente antagonizzato da XE991 (10?±M) e, in misura ancor più evidente, da Linopiridina (10±M) che ha riportato l’efflusso a valori sovrapponibili a quelli mostrati dal veicolo. Il blocco esercitato da XE991 e Linopiridina conferma ulteriormente il meccanismo d’azione ipotizzato in precedenza che vede nei canali Kv7 un target importante per l’azione esercitata da H2S sul sistema vascolare.
Bibliografia
Martelli A., Testai L., Breschi M.C., Blandizzi C., Virdis A., Taddei S., Calderone V. “Hydrogen sulphide: Novel opportunity for drug discovery”. Medicinal Research Reviews, 2010 Published online: 7 Dec 2010 | DOI: 10.1002/med.20234