SOCIETA' ITALIANA DI FARMACOLOGIA
Relazioni dei borsisti sif
RELAZIONE ATTIVITA’ SCIENTIFICA all'ESTERO
Dott.Tommaso Patriarchi
Università degli Studi di Siena
Attività svolta presso la University of California Davis (Marzo-Agosto 2011)
Il progetto è stato svolto in collaborazione con il Prof. Johannes Hell, presso il Dipartimento di Farmacologia della University of California Davis, il cui gruppo è all’avanguardia nell’identificazione e caratterizzazione delle proteine che compongono e regolano i complessi del canale al Calcio voltaggio-dipendente di tipo L CaV1.2. Questi complessi svolgono un ruolo fondamentale nei sistemi nervoso e cardiovascolare, nei quali la regolazione del canale di tipo L Cav1.2 da parte dei recettori β2-adrenergici (β2AR) svolge un ruolo da protagonista sia nella plasticità sinaptica che nella generazione del battito cardiaco nelle risposte “fight or flight” (Nichols et al., 2010). Soltanto di recente si è scoperto il ruolo fondamentale di questi complessi in una nuova forma di potenziamento a lungo termine (LTP), uno dei più studiati meccanismi di plasticità sinaptica che sottendono memoria ed apprendimento. I risultati di questi studi, ancora in fase di pubblicazione, mostrano che la forma di LTP basata sul ritmo “teta” (con frequenze tra 5 e 12 Hz) è
dipendente dalla regolazione dei canali al Ca2+ di tipo L da parte del β2AR (Quian and Hell, unpublished). In aggiunta, le importanti funzioni fisiologiche di questi complessi recettorecanale sono in gran parte basate sulla specifica disposizione delle proteine a valle di questa via di signaling, che risulta essere essenziale per rendere la traduzione del segnale allo stesso tempo altamente efficiente e veloce ma spazialmente e temporalmente ristretta (Weisenhaus et al, 2010; Dai et al., 2009). Il complesso del Cav1.2 nel cervello, oggetto della mia ricerca, contiene il β2AR, la proteina Gs, Adenilato Ciclasi (AC), PKA, PKC, Fosfatasi (PP2A, PP2B) e Fosfodiesterasi (PDE), con le “A kinase anchor protein” AKAP5 ed AKAP15 che ancorano la PKA al Cav1.2 insieme a PP2B e PKC (Davare et al., 2001).
La presenza delle AKAPs, proteine che “ancorano” al canale sia PP2B che PKA, le principali kinasi e fosfatasi coinvolte nella sua regolazione, è fondamentale per delimitare lo spazio in cui si trova il cAMP prodotto e garantire l’efficienza del signaling (Bailliea et al., 2005). Per approfondire il ruolo fondamentale di questa proteina, il laboratorio del Prof. Hell dispone di topi knock out (AKAP5 KO) e D36 (questi ultimi producono una versione di AKAP5 priva del sito di binding per PKA, non più in grado di ancorarla).
Tramite lo studio di questi animali modello con tecniche elettrofisiologiche e studi comportamentali, il laboratorio del Prof. Hell è stato in grado di associare i topi D36 ad un fenotipo con ridotti complessi di signaling dendritici e deficit di memoria ed apprendimento operativo.
Nell’ambito di queste ricerche, la prima parte del mio progetto è consistita nel caratterizzare i livelli di PKA associata ai complessi recettore-canale nei topi AKAP5KO e D36. Per far questo ho ottimizzato la tecnica di coimmunoprecipitazione, in maniera tale da mantenere intatta l’intera struttura del complesso assemblato insieme al canale al calcio CaV1.2.
In seguito l’ho applicata su lisati di cervello di topo wild-type (usato come controllo), KO e D36, per poi analizzare le variazioni nei livelli di PKA (sia le subunità catalitiche che regolatorie) tramite western blot.
I dati da me raccolti confrontando i livelli di PKA presenti nei complessi del canale CaV1.2 tra i diversi genotipi, mostrano una netta riduzione di questa proteina sia nei topi KO che D36, quantificata in circa il 50%. Il fatto che i livelli di PKA non vengano completamente annullati nel KO può essere dovuto alla presenza di AKAP15, che fornisce comunque un sito di ancoraggio per PKA, sebbene in misura meno rilevante per la regolazione del canale.
La seconda parte del mio progetto è consistita nella espressione e purificazione dei domini citoplasmatici del canale al calcio CaV1.2 (fusi con la Glutatione S-Transferasi) e del frammento C-terminale del recettore β2-adrenergico (fuso con la Maltose Binding Protein), per poter determinare tramite Pull-Down attraverso quali domini avvenga l’interazione
diretta tra le due proteine, un dato ancora indefinito che rappresenta un elemento chiave nel mantenimento dell’intera struttura del complesso. Tra tutti i domini del canale da me analizzati, soltanto un frammento C-terminale di circa 220 aminoacidi, siglato CT-1, si è dimostrato interagire direttamente con il β2-AR.
Nonostante le molte informazioni ottenute finora sulla fisiologia di questo importante complesso di signaling, molti aspetti sono ancora incompresi. Per esempio, ancora non si conoscono quali specifiche isoforme delle fosfodiesterasi (PDE) si trovano associate al complesso e tramite quali interazioni siano ancorate (se sfruttando lo scaffolding di AKAP5 o tramite un’interazione diretta con il Cav1.2). L’ottenimento di maggiori dati sulle modalità con cui queste proteine si associano nel complesso di signaling sarà parte del mio progetto futuro, il cui scopo ultimo è quello di arrivare a testare peptidi permeanti la membrana sviluppati in modo da distruggere in maniera selettiva da dissociare le PDE dal complesso e quindi, almeno in linea teorica, aumentare la regolazione dell’attività del Cav1.2 dal parte
della PKA. Questi nuovi peptidi potrebbero rappresentare una svolta nella terapia farmacologica delle patologie in cui questa via di signaling può risultare alterata e per le quali non esistono ancora terapie ottimali, come nel caso di alcune patologie cardiache,quali aritmie e scompenso cardiaco, o malattie neurologiche, quali epilessia e autismo.
Bibliografia
Bailliea G.S., Scott J.D., Houslaya M.D., 2005. Compartmentalisation of phosphodiesterases and protein kinase A: opposites attract. FEBS Letters 579: 3264–3270.
Dai S., Hall D.D., and Hell J.W., 2009. Supramolecular Assemblies and Localized Regulation of Voltage-Gated Ion Channels. Physyological Review 89(2): 411–452.
Davare M.A., Avdonin V., Hall D.D., Erik M. Peden,1 Alain Burette,3 Weinberg R.J., Horne M.C., Hoshi T., Hell J.W., 2001. A β2 Adrenergic Receptor Signaling Complex Assembled with the Cav1.2 Channel Cav1.2. Science 293(98): 98-101.
Nichols C.B., Rossow C.F., Navedo M.F., Westenbroek R.E., Catterall W.A., Santana L.F., McKnight G.S., 2010. Sympathetic Stimulation of Adult Cardiomyocytes Requires Association of AKAP5 With a Subpopulation of L-Type Calcium Channels.
Circulation Research 107: 747-756.
Weisenhaus M., Allen M.L., Yang L., Lu Y., Nichols C.B., Su T., Hell J.W., McKnight G.S., 2010. Mutations in AKAP5 Disrupt Dendritic Signaling Complexes and Lead to Electrophysiological and Behavioral Phenotypes in Mice. PlosOne 5(4): e1-e14.