SOCIETA' ITALIANA DI FARMACOLOGIA
Relazioni dei borsisti sif

Dott.ssa Gabriella Rodolico
Dipartimento di Medicina Sperimentale
Seconda Università degli Studi di Napoli
Relazione finale relativa all’attività scientifica svolta presso
Strathclyde Institute of Pharmacy & Biomedical Sciences
University of Strathclyde, Glasgow, UK
Luglio 2008 – Luglio 2009

“Imaging” della risposta immune in modelli murini di malattie cardiovascolari

L’infiammazione gioca un ruolo chiave nelle malattie cardiovascolari, in particolare, negli ultimi anni, consistenti evidenze sperimentali hanno sottolineato una fondamentale importanza della risposta immune nella patogenesi dell’aterosclerosi, spingendo i ricercatori a focalizzare i propri studi nel comprendere i meccanismi molecolari e cellulari alla base di tale risposta nella patologia vascolare (1-3). A tal fine, lo studio dell’aterosclerosi attraverso l’utilizzo di modelli murini riveste un ruolo di fondamentale importanza. I modelli murini più utilizzati sono i topi deficienti per l’apolipoproteina E (ApoE-/-) e i topi deficienti per il recettore delle lipoproteine a bassa densità (LDLr-/-), tuttavia, numerose limitazioni tecniche, quali la difficoltà di isolare le cellule immunitarie da vasi aterosclerotici o le limitate conoscenze della struttura linfoide secondaria e terziaria responsabile del drenaggio della patologia, rendono la comprensione dei processi patogenentici alla base della risposta immune vascolare alquanto difficile.
La microscopia multifotonica rappresenta un notevole passo in avanti nello studio del comportamento delle cellule immuni e della risposta immunitaria sia in vivo che in vitro. Tale tecnica, infatti, permette di rilevare la presenza di fluorofori, in profondità nel tessuto, in assenza di fototossicità, offrendo la possibilità di effettuare studi di imaging in 4 dimensioni (4D) (X-Y-Z-t). Ho trascorso la mia attività supportata dalla borsa di studio SIF, come Visiting Scholar, presso lo “Strathclyde Institute of Pharmacy & Biomedical Sciences” e il “Centre for Biophtonics” dell’Università di Strathclyde (Glasgow, UK). Il centro è altamente specializzato nell’imaging della risposta immune in vivo ed in situ (4,5). Sotto la supervisione del Dott. P. Maffia e del Prof. P. Garside, e nell’ambito del Dottorato di ricerca in Scienze Farmacologiche e Fisiopatologia Respiratoria della Seconda Università degli studi di Napoli (tutor Prof. L. Berrino), i miei studi sono stati finalizzati all’apprendimento di tecniche di microscopia quali: la microscopia multifotonica, confocale e la Laser Capture Microscopy. Lo scopo del progetto è quello di poter seguire e caratterizzare il movimento delle cellule T all’interno del tessuto vascolare aterosclerotico, verificare la presenza di organi linfoidi secondari e terziari capaci di drenare la patologia, caratterizzarli dal punto di vista della composizione cellulare e molecolare, e l’imaging in 3D e 4D di vasi aterosclerotici e della placca.
Per l’imaging delle cellule linfocitarie, e’ stato utlizzato il microscopio a multifotoni applicando tecniche di trasferimento di linfociti marcati in topi ApoE-/-. I topi sono stati sacrificati tramite eccesso di CO2. I linfociti sono stati isolati da linfonodi periferici (ascellari, inguinali, cervicali e mesenterici), prelevati da topi C57BL/6. La sospensione di cellule così ottenuta è stata lavata in 10 ml di RPMI 1640 (GIBCO BRL) per due volte tramite centrifugazione a 450 x g per 5 minuti. In seguito a centrifugazione il pellet è stato risospeso in HBSS (Invitrogen Life Technologies) in modo da ottenere una concentrazione di 5 x 107 cellule/ml. I linfociti sono stati marcati utilizzando il colorante cellulare Red CMTPX (Molecular Probes Inc.). Si è proceduto aggiungendo 500 μl del colorante (prelevati da una soluzione stock 20 mmol/L di CMTPX in DMSO) per ogni 107 cells in 1 mL di HBSS (Invitrogen) per 45 minuti a 37°C. Le cellule sono state, poi, lavate con mezzo di coltura privo di CO2 tramite centrifugazione a 400 x g per 5 minuti, e risospese in soluzione fisiologica in modo tale da poter iniettare per via endovenosa (attraverso la vena caudale) 3 x 107 linfociti in topi ApoE-/-. Ventiquattro ore dopo il trasferimento, l’arteria brachiocefalica e l’aorta addominale sono state prelevate ed utilizzate per l’analisi con il microscopio a multifotoni Titanium:sapphire laser system (Chameleon, Coherent Laser Group) (Radiance 2000MP, Bio-Rad Laboratories). I risultati preliminari ottenuti mostrano la possibilita’ di visualizzare chiaramente le cellule marcate e iniettate nell’animale con particolare distribuzione nell’avventizia dei vasi analizzati.
La microscopia confocale è stata utilizzata per l’imaging in 3D della placca aterosclerotica. L’aorta addominale prelevata da topi ApoE-/- (30-37 settimane) veniva tagliata longitudinalmente in modo da esporre il lume del vaso e le placche al suo interno. La preparazione en face dell’arteria veniva quindi colorata con Oil Red O (ORO) al fine di visualizare la componente lipidica e con il 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) specifico per i nuclei. La microscopia confocale e’ stata effettuata utilizzando un Leica TCS SP5 laser scanning confocal system (Leica DM6000B) e un obiettivo ad immersione l’HCX APO LUV1 20x.
I nostri risultati mostrano una ricostruzione in 3D della placca ad alta risoluzione. Lo staining con ORO e’ in grado di visualizzare l’accumulo di lipidi presente al di sotto della capsula fibrosa sovrastante la placca aterosclerosclerotica. L’autofluorescenza proveniente dalle fibre elastiche, permette di visualizzare il contenuto di elastina nella media e di avere un’indicazione del contenuto in matrice extracellulare presente nella capsula fibrosa. E’ stato inoltre possibile misurare le dimensioni della placca in esame (fino a 300 μM di altezza e 700 μM di diametro) e lo spessore della capsula fibrosa, grazie all’utilizzo del software Volocity 4 (Improvision). E’ altresi possibile quantifcare il numerio di macrofagi infiltrati la placca. Tale approccio rappresenta un importante tool per lo studio della formazione e dello sviluppo della placca aterosclerotica in 3D e per la valuatazione del potenziale terapeutico di trattamenti farmacologici.
Lo studio in vivo, attraverso l’immaging della risposta immune, nell’ambito delle malattie cardiovascolari, è stato per molto tempo limitato anche in altre patologie strettamente legate all’aterosclerosi come l’ictus, per tale ragione, durante il secondo semestre di attività mi sono dedicata all’immaging delle cellule linfocitarie T in situ in un modello murino di ischemia cerebrale (6). A tale scopo sono stati utilizzati topi hCD2-GFP transgenici che presentano cellule T esprimenti GFP. Tali topi sono stati sottoposti all’occlusione permanente dell’arteria cerebrale distale media (MCAO). A a 48 ore dalla MCAO sono stati prelevati i cervelli, ottenendo da questi una sezione sagittale (1500 µm di spessore) contenente le diramazioni cerebrali dell’arteria cerebrale media occlusa. Tale sezione è stata successivamente utilizzata per la microscopia multifotonica. I risultati ottenuti permettono, per la prima volta, l’imaging in real time, ex vivo, del comportamento dinamico delle cellule T nel cervello murino ischemico ed aprono la strada ad un futuro utilizzo di tale tecnica nello studio della risposta immune nel danno ischemico. Tali risultati sono attualmente in press sul British Journal of Pharmacology (6).
Colgo l’occasine per ringraziare la SIF del supporto ricevuto al fine di completare questa esperienza che mi ha sicuramente permesso di arricchire il mio bagaglio professionale.

BIBLIOGRAFIA
1. Hansson GK. N Engl J Med. 2005;352:1685-95.
2. Hansson GK, Libby P. Nat Rev Immunol. 2006;6:508-19.
3. Robertson AK, Hansson GK. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 2006;26:2421-32.
4. Zinselmeyer et al. J Exp Med. 2005;201:1815-23.
5. Schneider et al. Science. 2006;313:1972-5.
6. Ortolano,et al. Br J Pharmacol. 2009 Dec 10 [Epub ahead of print].